吴劲松细胞培养工作流程

2021年2月13日发(作者：什么是灰指甲图片)
细胞培养工作流程


一、

Vero
细胞复苏流程

1
、

准备

1.1
工作地点检查：

检查台面、地面是否洁净，确认无不相关物品。

1.2
设施检查：

确认空调、传递窗工作状态完好。

1.3
层流罩准备：

开启层流罩，观察其运行是否正常，用消毒剂将台面、墙面、地面、保护帘及层流
罩内设备进行清洁消毒 。并运行
30
分钟后开始生产操作。

1.4
操作工具和试剂检查：

检查本次操作所用灭菌物品外包装是否严密， 是否在效期内。检查本次操作所用溶
液
/
试剂瓶内是否有异物，
瓶表面是否有 裂纹，瓶塞是否松动，溶液名称、批号、数量、
有效期是否符合要求。合格后用消毒剂擦拭外表面后拿入 层流罩。复苏、换液用液体：
MEM
液、新生牛血清、
3%
谷氨酰胺溶液、庆 大霉素、
7.5%NaHCO
3
溶液。

1.5
复苏用水准备：

（
1
）融化种子用溶液：按
1L/1
支种子准备
39±1
℃含
0.1%
新洁尔灭溶液。

（
2
）百级内消毒种子用水：
1L/1
支种子准备
36 .5±1
℃含
0.1%
新洁尔灭溶液。




1.6
操作人员进入层流罩：

穿一层无菌连体服并戴无菌手套，静止
5
分钟后方可操作。

1.7
溶液使用前处理：

辅助人员用止血钳夹酒精棉球点燃后消毒瓶塞外表 面，旋转
1
周，操作人员将翻塞
翻开，再用点燃的酒精棉球消毒瓶口及瓶塞。

2
、

配液

配方


名称

MEM
培养基溶液

新生牛血清

3%
谷氨酰胺溶液

庆大霉素

7.5%NaHCO
3


辅助人员将配制所需的液体按顺序打开后 放至盐水瓶架上，
操作人员按配方加量用吸管
依次吸取新生牛血清等溶液至
MEM液中，
每吸完一种液后辅助人员应立即用无菌翻塞将其
盖紧，
在其瓶身用记号笔注 明用量、
日期等。
复苏液及生长液配完后辅助人员立即用无菌翻
塞将其盖紧，充分混匀 待用。

复苏液

加入量（
ml
）

100
10
1
0.1
1.5
含量控制范围

/
9%
～
10%
0.9%
～
1%
0.12%
～
0.13%
1.5%
～
1.8%
MEM
生长液

加入量（
ml
）

300
15
3
0.4
4.5
含量控制范围

/
4.5%
～
5.5%
0.9%
～
1%
0.12%
～
0.13%
1.5%
～
2%
辅助 人员打开混匀后的复苏液，放置盐水瓶架上。操作人员将培养瓶（
T175
）盖打开，
倾斜或直立放置酒精灯附近，
将复苏液用吸管吸取或直接倒入其中
（加量：
0.3～
0.4 ml/cm
2
）
，
拧紧瓶盖并放在恒温室待用。

3
、

种子支领

依据种子库管理规定进行支领，
依据生产指令按数量支领。
本操作规格按复苏
1
支细胞
种子到
1个
T75 cm
2
瓶规定各项操作。若支领数量变化培养瓶面积按比例调整，后续 操作各
项用量按比例调整。

4
、

种子速溶
< br>种子库管理员从细胞库刚取出细胞种子时，
在液氮罐颈部停留几秒，
核对所支领的种子< br>标签内容与细胞种子申领单上的内容是否一致。核对无误后，迅速全部浸入
39±1
℃含
0.1%
新洁尔灭溶液（
1000ml
/
支种子）
，顺时 针不停摇动直至融化，将每次的速融时间控制在
1
分钟内。
然后用
75%的酒精消毒容器外表面，
放置在传递窗内风淋
2
分钟。
同时马上通知细< br>胞区人员将种子从传递窗取走。迅速传递并浸入百级内
36.5±1
℃含
0.1 %
新洁尔灭溶液中，
百级内操作人员取出擦干。

5
、

移种

操作人员左手拿冻存管，
右手打开，
用
1ml
的吸管将融化后细胞种子吸出，
缓慢滴加到
1
个
T75 cm2
培养瓶中，拧紧瓶盖。

6
、

培养
辅助人员在培养瓶上注明细胞名称、
批号、代次、复苏日期、瓶编号等信息后及时放置
恒温 室静置培养。
24
小时内（细胞贴壁
80%
）进行换液。

7
、

清场

将废液倒入下水道，
废物、
待清洗物品由传递窗传到粗洗间，
层流罩内用
75%
酒精消毒，
再用纯水清洁 整个房间。

8
、

复苏后观察

第二天观察培养液颜色（
PH
）是否正常，在显微镜下观察细胞形态数量。

9
、换液

换液前准备与复苏前相同。
观察培养液颜色是否正常，< br>有无漏液，
看细胞是否生长良好。
用消毒剂擦拭表面后放入层流罩，
操作人员进 入层流罩换好无菌连体服后静止
5
分钟方可操
作。

辅助人员用酒精 棉球外焰消毒瓶塞外表面，
操作人员将翻塞翻开，
再用火焰消毒瓶口及
瓶塞。
操作人员右手拿住培养瓶底部，
左手拧开瓶盖，
轻轻翻转培养瓶使上清液沿其顶面流
至 废液缸。
辅助人员打开装生长液的瓶口，
并将其在火焰外焰旋转
1
圈后，放置盐水瓶架上
待用。
操作人员将培养瓶盖拧松放置酒精灯附近，
将生长液用吸管 吸取或直接倒入其中
（加
量：
0.3
～
0.4 ml/cm
2
）
。拧紧瓶口，平放到恒温室培养。最后按规定清场




二、

细胞传代流程

1
、

准备

1.1
工作地点检查：

检查台面、地面是否洁净，确认无不相关物品。

1.2
设施检查：

确认空调、蠕动泵工作状态完好。

1.3
层流罩准备：

开启层流罩，观察其运行是否正常，用消毒剂将台面、墙面、地面、保护帘及层流
罩内设备进行清洁消毒 。并运行
30
分钟后开始生产操作。

1.4
操作工具和试剂检查：

检查本次操作所用灭菌物品外包装是否严密， 是否在效期内。检查本次操作所用溶液
/
试剂瓶内是否有异物，瓶表面是否有裂纹，瓶塞是否松 动，溶液名称、批号、数量、有效期
是否符合要求。合格后用消毒剂擦拭外表面后拿入层流罩。

细胞传代用液体：
MEM
液，新生牛血清、
3%
谷氨酰胺溶液、庆大 霉素、
7.5%NaHCO
3
溶液、
0.01MPBS
溶液、细胞消 化液（含
0.25%
的胰蛋白酶溶液）
。

2
、

传代
1
操作

2.1
配液

配方


名称

MEM
培养基溶液

新生牛血清

3%
谷氨酰胺溶液

庆大霉素

7.5%NaHCO
3

MEM
生长液

加入量（
ml
）

400
20
4
0.5

8
含量控制范围

/
4.5%
～
5.5%
0.9%
～
1%
0.12%
～
0.13%
1.8%
～
2%
< br>向
MEM
中依次加入新生牛血清、
3%
谷氨酰胺溶液、庆大霉素、7.5%NaHCO
3
。
辅助人员
盖紧瓶口，在瓶身用记号笔注明用量、 日期等，混匀待用。

注意事项：无菌吸管不得碰触除尾部以外的任何地方，否则弃用。

2.2
洗涤

辅助人员将
PBS
打开，
用酒精灯将 瓶口消毒后放到盐水瓶架上待用。
操作人员将培养瓶
打开，将上清液沿培养瓶上表面倒至废液桶 。然后在酒精灯旁将
PBS
倒入培养瓶，倒入量：
30ml/
T75
cm
2
瓶。
（加量：
0.2
～
0.4
m l/cm
2
）盖上盖子，
PBS
交由辅助人员盖紧塞子，标记
用量、 日期。操作人员将培养瓶前后左右晃动一次后倒掉
PBS
。

注意事项：倒废液时注意不能污染瓶口。

2.3
消化

辅 助人员将消化液瓶口打开，
将瓶口用火焰消毒后放到盐水瓶架上待用。
同时将培养瓶
盖 子打开交由操作人员。操作人员用吸管吸
3ml
细胞消化液到培养瓶底，
（消化液加量 ：
0.02~0.04 ml /cm
2
）盖好瓶盖。辅助人员将消化液盖好，标记用 量、日期。操作人员翻转培
养瓶，
使细胞消化液铺满整个细胞面，
静置待细胞间质疏松 后翻转培养瓶，
使消化液盐沿培
养瓶上面倒入废液缸中，盖紧瓶盖置
36.5±0.5
℃恒温或室温继续作用
5
～
10
分钟。

注意事项 ：细胞培养瓶开盖后最好要
45°
倾斜，操作完成后马上盖好盖子。室温消化细
胞时肉 眼观察细胞面呈针眼状时应倒掉细胞消化液，避免细胞脱落。

2.4
悬液制备

辅助人员将生长液打开，
用火焰消毒后放到盐水瓶 架上待用。
操作人员将消化好的培养
瓶打开，用吸管吸
10ml
至
T 75
cm
2
瓶中，用吸管冲洗下细胞，吹打分散，制成均匀的细胞
悬液。

注意事项：分散细胞要充分，肉眼观察细胞无团块方可。

2.5
分种

操作人员将细胞悬液平均分种至
2
个
T175 cm
2
培养瓶中，
，加生长液至
75ml
。

2.6
培养

辅助人员将细胞的批号、代次、传代比例、瓶编号、日期标记在
2
个
T175
cm
2
细胞培
养瓶上，将接种细胞的培养瓶放置恒温室静置培养。

2.7
清场

按规定清场

2.8
观察

每天观察细胞生长状态

3
、传代
2
操作

3.1
配液

配方


名称

MEM
培养基溶液

新生牛血清

3%
谷氨酰胺溶液

庆大霉素

7.5%NaHCO
3

MEM
生长液

加入量（
ml
）

600
30
6
0.75
12
含量控制范围

/
4.5%
～
5.5%
0.9%
～
1%
0.12%
～
0.13%
1.8%
～
2%
< br>向
MEM
中依次加入新生牛血清、
3%
谷氨酰胺溶液、庆大霉素、7.5%NaHCO
3
。
辅助人员
盖紧瓶口，在瓶身用记号笔注明用量、 日期等，混匀待用。

注意事项：无菌吸管不得碰触除尾部以外的任何地方，否则弃用。

3.2
洗涤

辅助人员将
PBS
打开，
用酒精灯将 瓶口消毒后放到盐水瓶架上待用。
操作人员将培养瓶
打开，将上清液沿培养瓶上表面倒至废液桶 。然后在酒精灯旁将
PBS
倒入培养瓶，倒入量：
60ml/ T175 cm
2
瓶。
（加量：
0.2
～
0.4 ml/cm
2
）盖上盖子，
PBS
交由辅助人员盖紧塞子，标记
用量、日期。操作人员将 培养瓶前后左右晃动一次后倒掉
PBS
。

注意事项：倒废液时注意不能污染瓶口。

3.3
消化

辅 助人员将消化液瓶口打开，
将瓶口用火焰消毒后放到盐水瓶架上待用。
同时将培养瓶
盖 子打开交由操作人员。操作人员用吸管吸
7ml
细胞消化液到培养瓶底，
（消化液加量 ：
0.02~0.04 ml /cm
2
）盖好瓶盖。辅助人员将消化液盖好，标记用 量、日期。操作人员翻转培
养瓶，
使细胞消化液铺满整个细胞面，
静置待细胞间质疏松 后翻转培养瓶，
使消化液盐沿培
养瓶上面倒入废液缸中，盖紧瓶盖置
36.5±0.5
℃恒温或室温继续作用
5
～
10
分钟。

注意事项 ：细胞培养瓶开盖后最好要
45°
倾斜，操作完成后马上盖好盖子。室温消化细
胞时肉 眼观察细胞面呈针眼状时应倒掉细胞消化液，避免细胞脱落。

3.4
悬液制备

辅助人员将生长液打开，
用火焰消毒后放到盐水瓶 架上待用。
操作人员将消化好的培养瓶打
开，
将生长液直接倒入至
T175 cm
2
瓶中，
每瓶倒入量：
75ml,
用吸管冲洗下细胞，
吹打分散，
制成均匀的细胞悬液。

注意事项：分散细胞要充分，肉眼观察细胞无团块方可。

3.5
分种

操作人员将细胞悬液平均分种至
8
个
T175 cm
2
培养瓶中，加生长液至
75ml
。

3.6
培养

辅助人员将细胞的批号、代次、传代比例、瓶编号、日期标记在 细胞培养瓶上，将接种
细胞的培养瓶放置恒温室静置培养。

3.7
清场

按规定清场

3.8
观察

每天观察细胞生长状态

4
、

传代
3
操作

4.1
配液

配方


名称

MEM
生长液

加入量（
ml
）

含量控制范围