北京999急救中心TLR4siRNA国内外研究现状-中国肿瘤生物治疗杂志

2021年2月5日发(作者：怎样防止青春痘)
全部作者署名及工作单位
：

郭隽馥

苗兰英

王艳杰

丛培玮

4
位作者均工作于

辽 宁中医药大学【具体到院系、
研究所

实验室，请参看我刊已发表文章的格式，可从我刊 网站下载】

第一作者个人简介
：

郭隽馥（
1983.7-
）
，女，汉族，辽宁省沈阳市人，实验师，硕士学 位，主要从事肿
瘤分子遗传学方面的基础研究，电话：
5
，

，邮箱：
guojunfu@

通讯作者
：王艳杰，副教授，

博士 ，硕士生导师，研究方向：中医药对脏腑功能调
控作用的信号转导机制研究，
Email
：
@

基金项目：
①
国家自然基金

基于
TLR4
信号通路探讨培土生金法对
LPS
诱导的肺癌细胞
SPCA1增殖的影响（
81202789
）
；
②
辽宁省教育厅高等学校科 研项目

培土生金法对脾虚哮喘大鼠肺组织
AQP5
表达的影响
< br>（
No
：
2009A500
）
；③辽宁省博士启动基金项目< br>
培土生金法介导
TNF-a/NF-kB
信号通路调控哮喘气道黏液高分泌的 研究（
No
：
20111134
）

[
基金项目
]

按下述格式补充

国家自然科学基金资助项目（
No. 30901788,No.81272619
）。
Project supported by the
National Natural Science Foundation of China (No. 30901788,No.81272619).

[
作者简介
]

按下述格式补充（只介绍第一作者）
黄邵洪（
1976-
），男，福建省福州市人，博士，主要从事胸部肿瘤基础及临床研究。
E-mail:legendhuang@

[
通信作者
]

按下述格式补充

叶升（
Ye Sheng
，
corresponding author
）
，
E-mail:
yes20111212@
< br>siRNA
沉默
TLR4
表达对人肺腺癌
A549
细胞增殖和 侵袭的影响

郭隽馥

苗兰英

王艳杰
＊
丛培玮


【我刊对英文质量要求较高，题目、摘 要需严格对应中文翻译，并力求英文表达规范、准确。务必请英文功底
好的老师再次把关！
】< br>
【摘要】目的：探讨靶向
TLR4
基因的小干扰
RNA
（< br>small interference RNA
，
siRNA
）对人肺腺癌< br>A549
细胞增殖和侵袭的影响。
方法：
设计并合成针对
TLR4基因的
3
条
siRNA
（
siRNA
722
、
siRNA
1673
和
siRNA
2560
）
及< br>1
条与
TLR4
基因无同源性的阴性对照
siRNA
，
采用
Real-time PCR
和
Western blot
方法测定干扰后
A549
细胞中
TLR4
mRNA
及蛋白的表达水平，筛选出有效抑制靶基因表达的
siRNA
并确定最佳转染时间；
TLR4
特异性
siRNA
（
TLR4-siRNA
）转染
A549
细胞后，采用
CCK-8
法和
Transwell
小室法分 别检测沉默
TLR4
对
A549
细胞增殖和侵袭的影响。结果：与阴性对照相
比
siRNA
1673
在转染
48h
后对
TLR 4
mRNA
和蛋白表达的抑制最为明显
【此处请补充具体数据和统
计结果】
。
TLR4-siRNA
转染
72
h
后
A549
细胞增殖活性明显下降。转染
48
h
后，
TLR4-siRNA
组
A549
细胞的侵袭细胞数明显少于阴性对照 组【
（
23.60 ±
2.88
）个
vs
（
59.80 ±
5.54
）个（P
<0.01
）
】
。
结论：
TLR4-siRNA能沉默
A549
细胞中
TLR4
基因表达，
抑制
A54 9
细胞的增殖和侵袭能力，
TLR4
可能成为肺癌基因治疗的候选靶点。

关键词：肺癌；
TLR4
基因；
siRNA
；增殖；侵袭；


Effects of silencing
TLR4
expression by small interference RNA on proliferation
and invasion of human lung adenocarcinoma A549 cells
GUO Jun-fu MIAO Lan- ying WANG Yan-jie CONG Pei-wei
[
Abstract
]
Objective
: To investigate the effects of silencing
TLR4
expression by small interference RNA
(siRNA)
on
proliferation
and
invasion
of
human
lung
adenocarcinoma
A549
cells.
Methods
:
Three
siRNAs
(siRNA
722
,
siRNA
1673
and
siRNA
2560
)
and
one
negative
control
siRNA
were
designed
and
chemically
synthesized
to
inhibit
TLR4

gene
expression.
To
pick
out
the
siRNA
which
could
most
effectively
inhibit
the
expression
of
TLR4

in
A549
cells
and
identify
the
best
interference
time
we
detected
the
expression
levels
of
TLR4
mRNA
and
protein
by
using
Real-time
PCR
and
Western
blot
after
siRNAs
were
transected
into
A549
cells.
The
proliferation
and
invasion
of
A549
cells
were
determined by CCK-8 assy and
Transwell assay respectively.
Result
: siRNA
1673
was the most effective
siRNA which could significantly inhibit the expression of
TLR4
compared with negative control
group
48h
after
transection
into
A549
cells.

The
proliferation
of
A549
cells
in
the
TLR4-siRNA
group
was
significantly down-regulated compared with negative control group. And the invasion of A549 cells in the
TLR4-siRNA group was inhibited significantly compared with the negative control group [(23.60 ±
2.88)
vs
(59.80 ±
5.54) (
P
<0.01)].
Conclusion
: TLR4-siRNA can silence
TLR4
expression in A549 cells, and
inhibit the proliferation and invasion of A549 effectively.
TLR4
can be regarded as a candidate gene for
lung cancer gene therapy.
[Key words] lung carcinoma;
TLR4
gene; siRNA; proliferation; invasion;
肺癌是源于支气管粘膜或腺体的 恶性肿瘤，
发病率及死亡率高，
是世界范围内恶性肿瘤的主要
死因
[1]。研究发现，
Toll
样受体（
Toll like receptor
，
TLR
）在多种肿瘤中表达上调，与肿瘤的发生
进展密切相关，并在肿瘤的侵袭转移 过程中发挥着重要作用
[2-5]
。
TLR4
是人类发现的第一个
T LRs
家族蛋白，
主要介导革兰氏阴性菌感染时产生的脂多糖
（
LPS
）
的信号转导激活
NF-
κB
等信号通路，
引起炎症反应，从而发 挥早期免疫应答的作用。近期研究表明，
TLR4
在肿瘤的预转移阶段发挥重
要的功能 受体作用
[6]
。目前
TLR4
基因沉默对人肺腺癌
A549
细胞增殖和侵袭的影响尚未见报道，
因此本研究以
TLR4
基因为靶标，化学合成< br>3
条
TLR4-siRNA
，筛选有效的
siRNA
并确定最 佳转染
时间，进一步检测
TLR4
基因沉默对人肺腺癌
A549
细胞 增殖及侵袭的影响，以期为肺癌的基因治
疗提供新的靶点。

1

材料与方法

1.1

细胞系和试剂

人肺腺癌细 胞系
A549
购于中国科学院典型培养物保藏委员会，培养于含
10%
胎牛血 清、
100U/ml
青霉素和
100U/ml
链霉素的
DMEM培养液中，
37
℃
，
5% CO
2
饱和湿度培养，常规消化传
代，选取处于指数生长期细胞进行实验。

DMEM
培养基、 胎牛血清、双抗、
Trizol
试剂和
Lipofectamin2000
均 购于
Invitrogen
公司；
Real-time PCR
试剂盒购于< br>TaKaRa
公司；
细胞培养瓶、
培养板和
Transwell
细胞培养小室购于
Costar
公司；
Cell Counting Kit-8< br>试剂购于碧云天公司；
小鼠抗人
TLR4
单克隆抗体
（
ab2 2048
）
购于
ABcam
公司；兔抗小鼠Ⅱ抗购于北京博奥森公司。

1.2 TLR4-siRNA
的设计合成

siRNA
目的片 段的选取及合成：根据
GenBank
数据库提供的人
TLR4
全长基因设计 【挑选？】
RNAi
的靶区，设计
3
个
siRNA
序列，根 据把【靶？】序列其对应的
cDNA
起始点位置命名为
siRNA
722、
siRNA
1673
和
siRNA
2560
，另外设 计一条阴性对照（
negative control
，
NC
）序列，
Blast
查
询验证，排除与其他基因同源。以上核酸分子由上海吉玛制药有限公司设计合成 （表
1
）
。

表

1 siRNA
寡核苷酸序列

Tab.1 siRNA oligo sequences

Name
NC
siRNA
722

siRNA
1673

siRNA
2560

Sense
（
5
’
-3
’
）

UUCUCCGAACGUGUCACGUTT
CCACCUCUCUACCUUAAUATT
GGGCUUAGAACAACUAGAATT
GCUGGUGUAUCUUUGAAUATT
antisense
（
5
’
-3
’
）

ACGUGACACGUUCGGAGAATT
UAUUAAGGUAGAGAGGUGGTT
UUCUAGUUGUUCUAAGCCCTT
UAUUCAAAGAUACACCAGCTT
1.3
细胞转染

转染前一天，取生长状态良好的对数生长期
A549
细胞，胰酶消化，将其接种到
6
孔细胞培养
板中培养。
12~24 h
后
（汇合度：
50% ~70%
）
，
弃完全培养基，
PBS
洗一次，
加入
1 500
μl
无抗
DMEM
培养基培养。
5
μl lipofectamine2
000
与
250μl
双无
DMEM
培养基混匀后，
室温孵育
5 min,
。
5
μl siRNA
与
250
μl
双无
DMEM
培养基混匀后，
室温孵育
5 min
。
将以上两步所得溶液混匀，
室温放置
20 min
，
即
siRNA
转染液。将
siRNA
转染液加入已换成双无
DME M
培养基的
6
孔板中，混匀，继续培养
4~6 h
后，更换为无抗
DMEM
培养基培养，
24 h
后更换为含
10% FBS
的完全
DMEM
培养基。

1.4

有效
TLR4-siRNA
序列的筛选

实验分组：
NC
、
siRNA
722
、
siRNA
1673
和
siRNA
2560
，每种
siRNA
转染3
份（不同时间点【表
述太过简略，为便于读者理解，请解释“不同时间点”的含义】）
。转染后分别在
24
h
、
48
h
和
72
h
提取总
RNA
，
逆转录成< br>cDNA
后，
以
GAPDH
为内参，
Real-tine PCR
检测各组细胞内
TLR4
mRNA
的表达水平，反应条件为
95
℃
预变性
30 s
，
95
℃
变性
5 s
、
60
℃
退火及延
34 s
、进行
45
个循环，
每个样品 设置
3
个复孔，
在
ABI7500
实时定量
PCR
系统上进行，
实验重复
3
次。
TLR4
引物序列
[7]：
上游为
5
’
-CGAGGAAGAGAAGACACCAGT-3’
，下游为
5
’
-CATCATCCTCACTGCTTCTGT-3< br>’
。
GAPDH
引
物
序
列
[7]
：
上
游
为
5’
-GGATTTGGTCGTATTGGG-
3 ’
，
下
游
为
5’
-GGAAGATGGTGATGGGAT T-
3’
。

1.5

Western blot
检测蛋白表达水平

收集转染
24h
、
48h和
72h
后的
A549
细胞，用冰冷
PBS
洗
3
次，加入细胞裂解液提取蛋白。
用
SDS-PAGE
分离蛋白后，
将蛋白转移至
PVDF
膜上，
再用
5%
脱脂奶粉
-TBST
室温摇床封闭
1 h
，
加入小鼠抗人
TLR4
Ⅰ
抗（
1:1 000
）于
4
℃
摇床孵育过夜，用
TBST
洗涤
3
次，每 次
10 min
，并在
摇床上振摇，加入兔抗小鼠
Ⅱ
抗（
1:2 000
）
，于
37
℃
下孵育
1 h
，用
TBST
洗涤
3
次，每次
10 min
。< br>在化学发光仪上显色，实验重复
3
次。
【补充定量分析方法】


1.6

CCK-8
细胞增殖检测

取生长状态 良好的对数生长期细胞，常规胰酶消化，将细胞密度调整为
2-3×
10
4
个
/m1
，接种
于
96
孔培养板中，
每孔加入
100
μl
细胞悬液，
每组设立
3
个复孔。

12~24 h
后
（汇合度：
50%~70%
）
进行转染。分别在转染
2 4 h
、
48 h
、
72 h
和
96 h
后，每孔加入
10
?
l CCK-8
溶液，在细胞培养箱内继续孵育
1h
，酶标仪测定
450nm
波长
OD
值，绘 制生长曲线。实验重复
3
次。