动情素实验七 感受态细胞的制备和重组质粒的转化

2021年2月2日发(作者：尿急)
实验七

感受态细胞的制备和重组质粒的转化

【实验目的】

1.
掌握用
CaCl2
法制备感受态细胞的原理和方法。

2.
学习和掌握质粒
DNA
的转化和重组质粒的筛选方法。


【实验原理】

质粒在不同的细菌之间转移是微生物世界中一种普遍的现象 ，
一个细菌品系通过吸收另一个细菌品系
的质粒
DNA
而发生了遗传性状的改 变，这种现象叫做转化，获得了外源
DNA
的细胞称为转化子。


在基因克隆技术中，
所谓转化是指质粒或重组质粒被导入受体细胞，
表达相应的选择标记基因，
并在
一定的培养条件下，
在选择性培养基上长出转化子的过程。
质粒必须通过 转化进入细菌细胞内，
才能
进行扩增和表达，从而获得大量的克隆基因
,
使我 们能够进行进一步的
DNA
操作，如亚克隆等；或者
获得其表达产物。转化效率的高低 与受体菌的生理状态有关。细菌吸收外源
DNA
的能力最高时的状
态被称为感受态细胞 （
competent cell
）
。有些种类的细菌在其生长的任一阶段都处于感受 态，而另一
些细菌只有处于某个生长时期时（一般为对数生长早、中期）
，才会处于感受态,
如本实验所用的大肠
杆菌。用一定浓度的
CaCl2
处理对数生长早 中期的细菌可以大大提高细菌吸收周围环境中的
DNA
分
子的能力。对这种现象的一种 解释是
CaCl2
能使细菌细胞壁的通透性增强，从而提高转化率。这种转
化方法称为 “化学法”
。目前还可以使用电激的方法，通过瞬间的高压电流，在细胞上形成孔洞，使
外源< br>DNA
进入胞内，从而实现细胞的转化。电激转化的效率往往比化学法高出
1
到
2
个数量级，达
到
1 x 108
转化子
/
μ
g DNA
，
甚至
1 x 109
转化子
/
μ
g DNA
，
所以常用于文库构建时的转化或遗传筛选。


微生物转化 是基因工程的常用技术，
大肠杆菌是基因工程中最常用的受体菌，
本实验即是用前面实验
获得的重组质粒转化大肠杆菌细胞。


【试剂与器材】

〈一〉试剂

1
．
LB
液体培养基
:
参见附录






每组配
200mL,
其中
100mL
分装于
500mL< br>三角瓶中，
另各取
3mL
装于
2
只大试管中，
其余装 于
装于
500mL
三角瓶中，
121
℃高压蒸汽灭菌
20< br>分钟。

2
．
LB/Amp/IPTG/X-Gal
平板（< br>1
）
:

配
1L LB
液体培养基，加入
20g
琼脂粉和
1
支搅拌棒，同上高压灭菌，趁热取出置搅拌器上冷却，待
冷 至
55
℃左右
,
加氨苄青霉素
(Ampicillin)
至终浓度
100
μ
g/ml (Amp
储存液一般为
100mg/mL),
倒平板，
每皿倒约
15 mL
，
室温放置过夜至冷凝水挥发干净。< br>使用前半小时在培养基表面加
20
μ
L 50mg/mL X-gal
和
100
μ
L 0.1mol/L IPTG
，涂匀，待这两种化合物渗入琼脂后，即可用于转化菌的涂布。



每组制备
LB
平板
2
个，
LB/Amp
平板5
个，
LB/Amp/IPTG/X-Gal
平板
6
个。

3
．
IPTG
储存液
(0.1mol/L)
：
1.2g IPTG
加水至
50ml
，过滤除菌，
4
℃储存。

4
．
X-gal
储存液：
50mg/ml
溶于二甲基甲酰胺溶剂中 ，过滤除菌，
4
℃储存。

5
．
1 mol/L CaCl 2
储存液，
使用浓度为
0.1mol/L
，
CaCl2
应使 用分析纯，
配
100mL
，
高压灭菌，
全班用。

6
．甘油
(
灭菌
)
，全班
50mL
，同上高压灭菌 。

7
．酸洗无菌玻璃珠，涂布平板用，用
50mL
三角瓶分装，同 上高压灭菌，烘干备用。


〈二〉器材

1. 37
℃温箱、水浴锅、恒温振荡器等

2.
高速冷冻离心机

3.
微量移液器等


1
/
4



〈三〉菌株


大肠杆菌
DH5
α
，基因型为

【操作方法】

1
、感受态细胞的制备（无菌操作）
:
1
）从新鲜培养的
LB
平板上挑单个
DH5
α
大菌落接种到
3
mL
LB
培养液中（
2
）
，
37
℃剧烈振荡
（
210-240r/min
）培养过夜（
3
）
。

2
）取
1mL
过夜培养物
,
接种到含
100mL LB
培养液的
500 mL
锥瓶中，
37
℃剧烈振荡，直至培养液中
细菌浓度达到
OD600
为
0.375-0.4
（
4
）

3
）
培养物转入
2
只< br>50mL
离心管中，
冰上放置
10
分钟

，
4,000r/min, 4
℃离心
15
分钟，
弃上清< br>（
5
）
。

4
）将菌体悬浮于
10
～
20mL
预冷的
0.1mol/L CaCl2
溶液中
,
冰上放置
20
分钟
(6)
。

5
）
4,000rpm, 4
℃
,
离心
10
分钟，弃上清，然后将细菌轻轻悬浮在
2ml 0.1mol/L CaCl2
溶液中（< br>7
）
。若
不立即进行转化实验，则进行第
6
步操作，反之，则 进入转化操作。

6
）缓慢滴入甘油
(
灭菌
)
至终 浓度为
15
％
,
轻柔混匀，将细菌分装成
0.5ml/
每 管，立即液氮冷冻，转入
-70
℃冰箱储存，可在
2
个月内使用（
8
）
。


2
、感受态细胞的转化

1
）设计好实验项目，如正、负对照（参考如下表格，按表格内容操作）
；


2
）
从
-80
℃冰箱中取出分装成
0.5mL/
每管的感受态细胞
,
置冰上
5
分钟或缓慢流水淋至刚好解冻
（
10
）

，
立即分装到预冷的
1.5mL
离心管中，每管体积参见上表，插入冰上待用 ；

3
）对转化管，加入连接产物
DNA
溶液，轻轻混匀；为保险起 见，也可先加入一半的连接产物
DNA
溶液，轻轻混匀，剩下的一半置

-20
℃冰箱保存；

4
）冰上放置
30
分钟（
11
）
；
5
）放入
42
℃水浴中，热激
40
秒（
12
）
；

6
）迅速插入冰上，放置
5
分钟；

7
）对第
1
、
2
项，加入
500
μ
L LB
培养基，其余加入
250
μ
L LB
培养基
, 37
℃震荡培养
1
小时（
13
）
；

8< br>）对第
1
项，各取
200
μ
L
直接用玻璃珠涂布于< br>2
个
LB/ Amp/IPTG/X-Gal
平板上；对第
2
项，分别取
3
、
30
和
100
μ
L
细菌 培养液，
各加无菌水至
150
μ
L
（不超过
200
μ
L
）
涂
LB/ Amp/IPTG/X-Gal
平板
（此
步骤的目的是计算转化率）
；
对其余各项，
分别各取一半涂布于
LB / Amp
平板上，
余下的转化液置
4
℃
冰箱保存（
14< br>）
。倒置平板，
37
℃培养
12-14
小时。一般来说，含有 活性半乳糖苷酶的细菌比无活性
酶的细菌生长慢，
故过夜培养后可见到毫米大小的阳性白色菌落 而阴性的兰色菌落只有针尖大小
（
15
）
。

9
）挑取白色菌落进行鉴定（见下一个实验）
。


【注意事项与提示】

（
1
）倒平板时应避免培养基温度过高，若温 度过高，则加入的氨苄青霉素会失效，且培养基凝固后
表面及皿盖会形成大量冷凝水，
易于造成 污染及影响单菌落的形成。
若用手掌感受培养基觉得很烫但
尚可忍受时，培养基温度即为
55
℃左右。制备好的
LB/Amp
平板可于
4
℃冰箱储存
2
个月，时间过长

2
/
4