全口义齿图片内蒙古大学基因工程大实验思考题

2021年2月2日发(作者：义乌不孕不育医院)






本科生基因工程实验


(
记录及课后思考题
)















姓名
:
学号
:
专业
:
完成日期
:2012
年
9
月
9
日

指导老师
:




一、质粒
DNA
的小量制备

1.

影响最终质粒产量的主要因素有哪些？

①

与菌的生长状况有关

②

和提取时的温度有关，需要低温

③

加溶液Ⅱ、Ⅲ时操作要温和

④

要用酚和氯仿的混合液多次抽提去除蛋白质

⑤

要用冰乙醇沉淀

2.
提取到的质粒纯度将直接影响到以后的酶切效果，如何操作才能尽可能的避

免蛋白质的污染？

加入酚：氯仿：异戊醇去除蛋白质，氯仿可使蛋白质变性并有助于 液
相与有机相的分离。

二、质粒
DNA
电泳鉴定

1.

泳道的质粒
DNA
有几条带？为什么？


质粒可能会有超螺旋构型，
环状构型和线性构型。
这三种构型中，
迁移率最< br>快的应该是超螺旋的，其次是线性和环状。通常观察到的是超螺旋和环状质粒。

2.

溴酚蓝的迁移率相当于多少
bp
的
DNA
？

在< br>0.7%
、
1%
、
1.4%
、
2%
的琼脂糖 凝胶电泳中，
溴酚蓝的迁移率分别与
1000bp
、
600bp
、< br>200bp
、
150bp
的双链线性
DNA
片段大致相同
3.

影响本实验结果的因素有哪些？

DNA
的长度，结构，胶的浓度，电压等会对实验结果造成影响。

三、质粒
DNA
的酶切

1.

酶切反应混合物的体积是否对酶切效果有影响？为什么？

有影响

加入反应的酶体积不超过反应总体积的
1/10
，避免限制酶活性受到甘油的
影响。大 多数限制酶贮存在
50
％甘油溶液中，以避免在
-20
℃条件下结冰。

2.

如何估计
DNA
用量和酶的用量？

DNA
样品的浓度（
μ
g /
μ
l
）
:OD
260
×稀释倍数×50/1000

1U
酶切割
1ug
的质粒，酶的量不要超过酶切体系的
1/10。

3.

在吸取内切酶的时候如何操作才能避免浪费？

将枪头不要插入液体很深部位，刚过液面且可以吸取所需的体积的液体。

四、
PCR
扩增制备目的基因

1.

复性温度是根据什么确定的？

可以根据公式：
2
（
A + T
）
+ 4
（
C + G
）
，再减
5-10
度
,
一般为
55
℃
-60
℃

当
50
％的引物和互补序列表现为双链
DNA
分子时的温度
.Tm
对 于设定
PCR
退火温度是必需的。
在理想状态下，
退火温度足够低，
以保证引物同目的序列有
效退火，
同时还要足够高，
以减少非特异性结合。
合 理的退火温度从
55
℃到
70
℃。
退火温度一般设定比引物的
Tm
低
5
℃。

双链
DNA
中的
G+C
的比率越高，则双链
DNA
分离变性的温度也就越高。
变性所需的时间与DNA
分子的长度

相关，
DNA
分子越长，在特定的变性温< br>度下使双链
DNA
分子完全分离所需的时间就越长。

若变性温度太低或变性
时间太短，则只能使
DNA
模板中富含
AT
的区域产生变性，当
PCR
循环中的
反应温度降低时，部分变性的
DNA
模板又重新结合成双链
DNA
，从而导致
PCR
的失败。非特异性条带数增多。

2.

引物序列是根据什么设计的？为什么要加上酶切位点序列？