山西省中医学院实验六 PCR产物的TA克隆 (DNA的胶回收和连接)

2021年2月2日发(作者：造影疼吗)
实验六

PCR
产物的
TA
克隆

(DNA
的胶回收和连接
)
【实验目的】

1.
掌握
DNA
回收和连接的基本原理。

2.
学 习和掌握
PCR
产物的
T-vector
克隆。


【实验原理】


片段回收方法：
DNA
片段在适当浓度的琼 脂糖凝胶中，通上一定电压进行电泳，不同大小的
DNA
分子由于迁移率的不同而分离开。切下 带有所需
DNA
片段的凝胶，用冻融法、玻璃奶回收法或
商品化胶回收试剂盒将目的片 段回收纯化。


2.
利用
Taq
酶能够在
PCR
产物的
3
’末端加上一个非模板依赖的
A
，而
T
载 体是一种带有
3
’
T
突出
端的载体，在连接酶作用下，可以把
PCR
产物插入到质粒载体的多克隆位点，可用于
PCR
产物的克
隆和测序 。


商品化的
T
载体有很多。本实验采用
TaKaRa< br>公司的
pMDTM18-T Simple Vector
。这个载体以
pUC 19
载体为基础，消除了
pUC18
载体上的多克隆酶切位点，经
EcoR< br>Ⅴ酶切后在两侧的
3
＇端添上“
T
”制
备而成（见附录
1
）
。由于本载体上消除了多克隆酶切位点，克隆后的
PCR
产物将无法使 用载体上的
限制酶切下，需要在
PCR
扩增引物上导入合适的酶切位点。


【试剂与器材】

（一）

试剂

18-T Simple Vector Kit
（
Takara
公司）
。



电泳缓冲液

3.
琼脂糖（
Agarose
）

4.6
×电泳加样缓冲液：
0.25
％

溴粉蓝，
40
％
(w/v)
蔗糖水溶液，贮存于

4
℃。


5.
溴化乙锭
(EB)
溶液母 液：配制成
10mg/mL
，用铝箔或黑纸包裹容器，储于室温即可。

6.70%
乙醇

7.
胶回收试剂盒（
Omega
公司）


（二）器材

水平式电泳装置
,
电泳仪
,
台式高速离心机
,
恒温水浴锅
,
微量移液枪
,
微波炉或电炉
,
紫外透射仪
,
凝
胶成像系统或其它照相设备。


【操作方法】

（一）胶回收试剂盒回收
PCR
产物（以
Omega
公司

Gel Extraction Kit
为例）


1.
当 目的片段
DNA
完全分离时，转移凝胶至紫外灯上尽可能快地切下目的片段。


2.
凝胶块转移至
1.5ml
离心管
(
离心管已 经称重了
)
中，
称重得出凝胶块的重量。
近似地确定其体积
（假设其密度为
1g/ml
）
。加入等体积的
Binding
Bu ffer
（
XP2
）
，于
55-65
℃水浴中温浴
7min
或至凝胶完全
融化，每
2-3 min
振荡混合物。
（在凝胶完全溶解之后，注意凝胶
-Binding buffe r
混和物的
pH
值。如果
其
pH
值大于
8
的话，
DNA
的产量将大大减少。如果是橙色或红色，则要加入
5
μ
l
浓度为
5
M
，
pH
为
5.2
的醋酸 钠，以调低其
pH
值。该混合物的颜色将恢复为正常的浅黄色。
）

3.
取一个干净的
HiBind DNA Mini
柱子装在一个干凈的
2ml
收集管内（已备好）
。

4.
将第三步获得的
DNA/
熔胶液全部转移至柱子中。
室温下
1 0,000 x g
离心
1
分钟。
弃收集管中的滤液，
将柱子套回< br>2ml
收集管内收集管。

5.
如果
DNA/
凝胶熔 液的体积超过
700ul
，一次只能转移
700ul
至柱子中，余下的可继续 重复第
5
步至

1
/
4


所有的溶液都经过柱子。每一个
Hibind
DNA
回收纯化柱都有一个极限为
25
μ
g
DNA
的吸附能力。如
果预期产量较大，则把样品分别加到合适数目的柱子中。

6.弃收集管中的滤液，
将柱子套回
2ml
收集管内收集管。
转移
3 00
μ
l Binding Buffer
（
XP2
）
至柱子中，
室温下，

10,000 x g
下离心
1min
。

7.
弃 收集管中的滤液，
将柱子套回
2ml
收集管内收集管。
转移
700< br>μ
l SPW Wash buffer
（已用无水乙醇
稀释的）至柱子中。室 温下
10,000xg
离心
1min
。
（浓缩的
SPW Wash Buffer
在使用之前必须按标签的
提示用乙醇稀释。如果
DNA
洗涤缓冲液在使用之前是置于冰箱中的，须将其拿出置于室温下）
。


8.
重复用
700
μ
l SPW Wash buffer
洗涤柱子。室温下
10,000xg
离心
1min
。

< br>9.
弃收集管中的滤液，将柱子套回
2ml
收集管内收集管。室温下
, 13,000
x
g
离心
2
min
以甩干柱子基
质残余的液体。


10.
把 柱子装在一个干凈的
1.5ml
离心管上，
加入
15~30
μ
l
（
具体取决于预期的终产物浓度）
的
Elution
Buff er(
或
TE
缓冲液
)
到柱基质上，
室温放置
1m in, 13,000xg
离心
1min
以洗脱
DNA
。
第 一次洗脱可以洗
出
70-80%
的结合
DNA
。

如果再洗脱一次的话，可以把残余的
DNA
洗脱出来，不过那样的浓度就会
较低。

（二）连接反应（以
Takara
公司
pMDTM18-T Simple Vector Kit
为例）



1
）在微量离心管中配制下列
DNA
溶液，全量为
5
μ
l
。



pMDTM18-T Simple Vector
1 μl


Insert DNA
0.1 pmol
～
0.3 pmol

dH2O
up to 5 μl



2
）加入
5
μ
l
（等量）的

Solution I
。



3
）
16
℃反应
30
分钟。
（
2 kbp
以上长片段
PCR
产物进行
DNA
克隆时，
连接反应时间请 延长至数小时）
。


4
）全量（
10
μ
l
）加入至
100
μ
l
感受态细胞中，冰中放置
30
分钟。


5
）42
℃加热
45
秒钟后，再在冰中放置
1
分钟。


6
）加入
890
μ
l LB
培养基，
37
℃振荡培养
60
分钟。

7
）在含有
X-Gal
、
IPTG
、
Amp
的
LB
琼脂平板培养基上培养，形成单菌落。计数白色、蓝色菌落。


8
）挑选白色菌落，鉴定载体中插入片段的长度大小。


【注意事项与提示】

1.
使用新鲜的电泳缓冲液
TAE Buffer
。不要重复使用，其
PH
的升高会减少产量。

2.< br>不论采取何种方法回收
DNA
，在回收过程中，要尽量减少洗脱体积，以便提高收得率和 浓度，以方
便后续操作。

3.
从胶上回收
DNA
时，应尽 量缩短光照时间并采用长波长紫外灯
(300-360nm)
，以减少紫外光对
DNA
的切割。
DNA
曝露在紫外灯下不能超过
30
秒。

4.
连接反应时间是与温度密切相关，
因为反应速度随温度的提高而加快。
通常可采 用
16
℃连接
4
小时
为宜，
如是平端连接需要适当延长反应 时间以提高连接效率；
在选择反应的温度与时间关系时，
也要
考虑在反应系统中其他因 素的影响。

5.
连接反应的整个过程应注意枪头的洁净以避免造成对酶的污染，为防 止酶活性降低，取酶时应在冰
上操作且动作迅速。
7.




6.
连接反应应在
25
℃以下进行，温度升高较难形成环状
DNA
，影响连接效率。长片段
PCR
产物（
2kb
以上）进行连 接时，连接反应时间应延长至数小时。

7.
进行克隆时，
Vector DNA
和
Insert DNA
的摩尔数比一般为
1:2~10
。根 据实验情况选择合适的摩尔数
比。

8.
用高效的感受态细胞（转化效率≥
1
×
108 cfu/
μ
g pUC19
）
，这样才可能得到比较理想的阳性克隆。


2
/
4