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西安不孕不育医院质粒DNA的提取、定量、酶切与PCR鉴定实验报告

作者:陕西保健网
来源:http://www.xapfxb.com/yuer
更新日期:2021-02-02 18:07

鼻头鼻尖整形-牛耳枫

2021年2月2日发(作者:肾上腺)

质粒
DNA
的提取、定量、酶切与
PCR
鉴定

一、实验目的

1
.
学习并掌握用碱裂解法提取质粒
DNA
的方法;

2
.
学习并掌握了解质粒酶切鉴定的方法;

3
.
学习并掌握紫外吸收检测
DNA
浓度和纯度的原理和方法;

4
.
学习并掌握
PCR
基因扩增的实验原理和操作方法;

5
.
学习并掌握水平式琼脂糖凝胶电泳的原理和使用方法。

二、实验原理

1
.
PCR(
多聚酶链式反应
)



DNA
聚合酶催化下,
可以
DNA
为模板,
以特定引物为延伸起点,

dNTP
为原料,
通过变性、退 火、延伸等步骤,

在体外(缓冲液中)复制
DNA
,使目的
DNA

2
n

式呈指数形式扩增。

PCR
一次循环的具体反应步骤为:

A.
变性:加热反应系统至< br>95

,使模板
DNA
在高温下完全变性,双链解链



B.
退火:
逐渐降低溶液温度,
使合成引物在低温(
35

70

,
一般低于模板
Tm
值的< br>5

左右),与模板
DNA
互补退火形成部分双链。

C.
延伸:溶液反应温度升至中温
72
℃,在

Taq酶作用下,以
dNTP
为原料,引物为复
制起点,模板
DNA
的 一条单链在解链和退火之后延伸为一条双链。


2
.
质粒
DNA
的提取与制备

(1).
碱裂解法:

染色体
DNA
与质粒
DNA
的变性与复性存在差异:
A.
高碱性条件下,染色体
DNA
和质粒
DNA
均变性;


B.
当以高盐缓冲液调节其
pH
值至中性时,变性的质粒DNA
复性并保存在溶液中,染
色体
DNA
不能复性而形成缠连的网状结 构,可通过离心形成沉沉淀去除。

(2).
离心层析柱:

A.< br>硅基质膜在高盐、

pH
值状态下可选择性地结合溶液中的质粒
DNA

而不吸附溶液
中的蛋白质和多糖等物质;

B.
通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除;

C.
低盐 ,高
pH
值的洗脱缓冲液将纯净质粒
DNA
从硅基质膜上洗脱。

3.
质粒
DNA
的定量分析(紫外分光光度法):

A.
物质在光的照射下会产生对光的吸收效应,且其对光的吸收是具有选择性;

B.
各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱
:
DNA
分对波长
260nm
的紫外光有特异的吸收峰

蛋白质对波长
280nm
的紫外光有特异的吸收峰

碳水化合物对
230nm
的紫外光有特异的吸收峰

C.
A 260/A280

A260/A230
的比值可以反应
DNA
的纯 度;

A260/A280=1.8






DNA
纯净

A260/A280<1.8






表示样品中含蛋白质(芳香族)或酚类物质

A260/A280>1.8







RNA
杂质,用
RNA
酶去除。




4.
质粒
DNA
的酶切鉴定:

限制性内切酶是
DNA
重组操作过程中所使用的基本工具。限制性内切酶能特异性地与
一段被称为限制 酶识别序列的特殊
DNA
序列结合,或是与其附近的特异位点结合,并
在结合位点切割 双链
DNA



5.
琼脂糖凝胶电泳:
< br>琼脂糖是一种天然聚合长链状分子,可以形成具有刚性的滤孔,凝胶孔径的大小决定于
琼脂糖的浓 度。

DNA
分子在碱性环境中带负电荷,在外加电场作用下向正极泳动。

DNA
分子在琼脂糖凝胶中泳动时,有电荷效应与分子筛效应:不同的
DNA
,分子量大小
及构型不同,电泳时的泳动率就不同,从而分出不同的区带
(
迁移速度与 分子量的对数
值成反比关系
).
三、材料与方法:


(一)实验材料:

1
.
PCR

仪器:
PCR
仪、台式离心机、微量加样枪、灭菌的薄壁离心管

材 料:菌液【大肠杆菌
DH5a
菌株
(
pMD19
-
T
质粒
,
含目的片段
-
绿色荧光蛋白
GFP
)
】、
无菌去离子水、
2
×
Premix

Taq
、引物

2
.
质粒
DNA
的提取与制备

仪器:恒温培养箱、台式离心机、离心层 析柱、
Eppendorf
管、微量加样枪、离心管

材料:溶液

P1

S1
)、溶液
P2
(
S2
)、溶 液
P3

S3
)、去蛋白液
PE

W1
) 漂洗液
WB

W2
)、洗脱液
EB

Eluent
)
、含
pMD19
-
T
质粒的大肠杆菌
DH5α

3
.
质粒
DNA
的定量(紫外分光光度法)

仪器:比色杯、紫外分光光度计、微量加样枪

材料:蒸馏水、质粒DNA

4
.
质粒
DNA
的酶切鉴定

仪器:
1
.
5ml

EP
管、微量加样枪

材料:无菌水、
10×
M
酶切缓冲液
Buf R
、质粒
DNA

Hind III (15U/ul)

EcoR I(12U/ul)
5
.
琼脂糖凝胶电泳


仪器:凝胶电泳系统、凝胶成像系统

材料:电泳指示剂、
Gelview< br>、
TBE
、琼脂糖、
DNA Marker 5000
、电泳缓冲液

(二)实验方法

1
.
PCR


准备目的
DNA
:菌液煮 沸
10min
,冷冻,室温解冻后离心取上清液














2
.

质粒
DNA
的提取与制备

将扩增后的基因用微量加样枪加到电泳仪的凝胶孔中

将装有
PCR
反应体系的
PCR
反应管放入
PCR
仪上进行如下操作:


94
℃预变性
5
分钟后开始以下循环

②循环为
94
℃——
30
秒,
50
℃——
30
秒,
72


——
1
分钟。循环为
30



72


5
分钟


4



保温









PCR
反应管置台式离心机中瞬时离心


0.2 ml PCR
反应管一只,用微量加样枪按下述顺序分别加入:灭菌去离子 水
5.5μl

2*Premix Taq12.5μl

引物
1 (10 mol/L) 1μl

引物
2 (10 mol/L) 1μl

菌液
5μl






13000rpm

x

1min
,弃上清

1
.
5ml
培养物加入
Eppendorf
管中

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