忧郁症怎么治疗DNA重组生物实验报告讲解

2021年2月2日发(作者：动漫女孩触手)
DNA
重组生物实验报告


课程名称：
_
生命科学导论实验课
_
指导老师：
______
成绩：
__________________
实验名称：
__
基因工程实验
__

实验类型：
__
生物实验
_______
同组学生姓名：
__

一、实验目的和要求

基因工程实验是生物实验中极具代表性的一部分，在此次实验中有如下目的和要求：

1
、

通过本实验了解和掌握含
GFP
基因质粒的提取和琼 脂糖
DNA
电泳的等十个小实验组合而成的
基因工程实验的原理和技术。

2
、

了解生物实验的完整流程，对实验室基本操作规范与仪器设备使用方法 得到初步了解，从而
建立系统、有条理的实验思路。

3
、

培养实验动手能力，在实践中加强对专业知识的认知与体会，融汇贯通，寓学于用，感受生
物学科的魅 力。

二、实验内容和原理

基因工程又称
DNA
重组技术 ，是将不同来源的基因按照预先设计的蓝图，在体外构建成杂种
DNA
分
子（又称重组
DNA
分子），然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性，获得新品种和生产新产品等。< br>基因工程技术为生命科学的研究提供了有力的手段，
同时为以基因工程技术为核心的现代生物技术 产业的
建立奠定了扎实的基础。

基因工程技术建立的标志性实验是：①
19 72
年，美国斯坦福大学的伯格
()
等人将猿猴病毒
SV40
的DNA
和大肠杆菌
λ
噬菌体
DNA
分别进行
EcoRI
酶切，然后用
T
4
DNA
连接酶将两个酶切片段进行连
接，
率先完成了人类历史上第一个
DNA
分子的体外重组实验，
因此荣获了
1980
年的诺贝尔化学奖。
②
1973
年，美国斯坦福大学的科恩（
）等人在体外构建了含四环素和链霉素两个抗性基因的重组质粒，
并将其导入大肠杆菌中， 获得了双抗性的大肠杆菌转化子，成功完成了第一个基因克隆实验。上述两大科
研成果标志着基因工程技 术的诞生。

一个典型的基因工程技术包含以下几个步骤：

1.

目的基因和载体
DNA
的获取。

2.

目的基因和载体
DNA
的限制性内切酶的酶切消化。

3.

酶切后的目的基因和载体
DNA
的体外重组连接，以获得重组
DNA
分子。

4.

通过细菌转化等技术，将重组
DNA
分子导入细菌等活细胞。

5.

转化细胞的筛选鉴定以及目的基因表达的检测。

其中目的基因、载体、工具酶及宿主细胞是缺一不可的，因此被称为基因工程的四大要素。

实验一

含
GFP
基因质粒的提取

目前获取目的基因
DNA
片段常用方法是：从
Gene Bank
中 查得目的基因的
DNA
序列，根据序列设计引
物，通过
PCR
的方法 扩增目的基因的
DNA
片段。

根据目的基因的来源不同，用于
PC R
扩增的模板
DNA
，大致有两个来源：①由于真核细胞
DNA
的基 因
编排方式，是由内含子和外显子等组成，因此，只能通过提取目的基因的
mRNA
， 逆转录合成出
cDNA
，作
为
PCR
的模板。②原核生物的
DNA
其基因是连续的。因此提取原核细菌的
DNA
，就可用于
PCR
的扩增。本
次实验的目的基因就是来自一种细菌编码的脂肪酶基因。

细菌基因组< br>DNA
的提取先是用溶菌酶及蛋白酶
K
裂解细胞，
释放
DNA
、
RNA
及蛋白质等。
然后用苯酚
/
氯仿处理，使蛋白质变 性，经离心去除蛋白质及细菌碎片，
DNA
和
RNA
存在于上清水相中，然后 用
RNase
分解
RNA
，酒精沉淀
DNA
，即可获取目标 基因组
DNA
。

实验二

琼脂糖
DNA
的电泳

DNA
分子是两性电解质，
在溶液中形成兼性离子而携带电荷，
带电分子在电场中将产生移动，
这种现象
称为电泳 。带电分子在电场中移动的快慢，除受到场强、缓冲液类型及缓冲液离子强度等外界因素的影响
外，还受 到分子的大小、带电量及分子的形态等自身因素的影响。为避免断电后电泳分开不同
DNA
分子 的
迅速扩散混合，
DNA
电泳常采用琼脂糖的凝胶电泳。

实验三
PCR
扩增目的基因

1985
年美国
C etus
公司的穆利斯等人设计并研究成功了一种体外核酸扩增技术
PCR
（
Polymerase
Chain
Reaction
）
，从而荣获了1993
年诺贝尔化学奖。这种聚合酶链式反应是一种类似于细胞内
DNA
的天< br>然复制过程，利用半保留复制的原理，以待扩增的
DNA
为模板，在体外由引物介导的酶 促合成特异的
DNA
片段。将目的基因
DNA
在高温（
94
℃）下解链成为单链模板；人工合成的一对与目的基因两侧序列相互补
的寡核苷酸引物在低温（
40
～
60
℃）下分别与变性的目的基因片段两侧的两条链的部分序列互补结合；在< br>中等温度（
65
～
75
℃）下由耐热
DNA
聚合酶（
Taq
酶）将
dNTP
中的脱氧单核甘酸加到引物
3’
-O H
末端，
并以此为起点，
沿着模板以
5’→3’方向延伸，
合成一条 新的互补链。
新合成的
DNA
链的起点是由加入的
引物在模板
DNA
链两端的退火位点决定的。

由于
PCR
反应中，双链
DN A
高温变性成单链，引物与模板单链
DNA
低温退火（配对）
，适温下引物延
伸
3
个步骤反复循环，每一循环所形成的
DNA
分子均能成为下一循 环的模板，所以
PCR
的特定目的
DNA
产
30
9
物以指数方式递增，在数小时内，经过
30
个循环后，理论上可使
DNA
扩增 至
10
亿（
2
=10
）倍。并且原
来对单拷贝基因进行探测 和分析时需用
10
μ
g
基因组
DNA
，现在可以减少到ng
水平。


样品
DNA
预变性

双链
DNA
解链，
94
℃
5min


引物与单链模板
DNA
结合

30-60
℃，
30
秒
-



双链
DNA
解链

聚合酶合成新链

94
℃、
40
秒
65-75
℃、
2min




延伸反应完成

实验四
PCR
产物的纯化

实验五
DNA
的酶切反应

基因工程技术必不可少的工具酶之一， 是限制性内切酶，它能识别和切割双链
DNA
分子内特殊碱基序

2
列。根据其结构和作用特点分成Ⅰ型、Ⅱ型及Ⅲ型
3
大类，Ⅰ型和Ⅲ型核酸限制性内切酶一般 由两个亚基
构成，既具有内切酶的活性，又有甲基化酶的活性，Ⅰ型和Ⅲ型识别位点固定但酶切位点不固 定。而Ⅱ型
酶其核酸内切酶活性和甲基化酶作用活性是分开的，而
II
型酶识别位点固 定同时酶切位点也是固定的，
因此基因工程中应用的是Ⅱ型核酸限制内切酶。

核酸限 制性内切酶的命名：
以
EcoRI
为例，
第一个大写字母
E
为大肠杆菌的属名的第一个字母；
第二、
三个字母
co
为大肠杆菌的种名的头 两个字母；第四个字母
R
为大肠杆菌的菌株名；最后一个罗马数字表
示该细菌中已分离 出这类内切酶的顺序编号。

实验六
DNA
酶切产物的过柱纯化

实验七

质粒的提取

将一个有用的目的
DNA
片 段通过体外重组技术，转移进宿主细胞中进行繁殖及表达的工具称为载体。
载体种类很多，根据目的不同 选用相应的载体，其中质粒是最常用的载体。

质粒（
plasmid
）是一 种独立于染色体之外的双链
DNA
，可自主复制、携带了少量的遗传信息（如：
抗生素 抗性基因）
，自然界质粒存在于原核生物及低等的真核生物（如酵母、霉菌）
，自然界发现的质 粒均
有缺陷，必须经过改造才能应用于基因工程。理想的质粒载体包含：①一个复制起点②选择性抗性标 记③
人工合成的多克隆位点（
multiple cloning site
，
MCS
）含有多个核酸限制性内切酶位点④具有较小的相
对分子量和较高的拷贝数。

质粒具有不相容性（
incompatibility
）或不亲和性，是指在没有选择 压力的条件下，两种亲缘关系
密切，携带相同复制原点的不同质粒不能在同一宿主细胞内稳定地共存的现 象。

质粒的提取常用碱法提取：
利用表面活性剂
SDS
溶解细胞膜 上的磷脂和蛋白质，
在
PH
高达
12.6
的碱
性条件下使染 色体
DNA
变性，而分子量较小的质粒
DNA
只是部分变性，当醋酸钾重新调 回
PH
至中性时，
质粒复性恢复原状，而该复性条件下染色体
DNA
不能完全复性而形成缠连的网状结构，与菌体蛋白及细菌
碎片凝集成块，经离心去除，而上清中含有质粒
DNA
、少量蛋白及
RNA
，经去除蛋白及
RNA
后，即可 获取
质粒
DNA
。


pBSSK
质粒的图谱


实验八
DNA
的重组连接

质粒与目的基因经核酸限制性内切酶酶切后形成的
DNA
末端有两
类：平末端和黏性末端。按照一定比例将质粒和目的基因混合后，加入
DNA
连接酶，
DNA
连接酶能酶促合成相邻核苷酸之间的单链缺口，
形成磷
酸二酯链，很显然，含黏性末端的
DNA
片段之间的连接效率，要明显高
于平末端的
DNA
片段间的连接。


实验九

感受态细菌的制备

DNA
重组分子体外构建完成后，必须导入特定 的宿主（受体）细胞，使之无性繁殖并高效表达外源基
因或直接改变其遗传形状，这个导入过程及操作统 称为重组
DNA
分子的转化（
transformation
）
。在 原核
生物中，转化是一个较普遍的现象。在细胞间转化是否发生，一方面取决于供体菌与宿主菌两者在进 化过
程中的亲缘关系，另一方面还与宿主菌是否处于一种感受状态有着很大的关系。

所谓感受态，即指宿主细胞最易接受外源
DNA
片段并实现其转化的一种生理状态，它是由宿主 菌的遗
传特性所决定，同时也受菌龄、外界环境因子等影响。据报道
cAMP
可以使感 受态水平提高
10000
倍，而

3
Ca
也可大大促进转 化作用。细胞的感受态一般出现在指数期，新鲜柔嫩的细胞是制备感受态细胞和进行
2+
成功转 化的关键。
对于
Ca
诱导的完整细胞转化而言，
菌龄、
CaCl2
处理时间、
感受态细胞
（
competent
cell）
的保存期以及热击时间均是很重要的因素，其中感受态细胞通常在
12
～
24h
内转化效率最高，之后转化率
急剧下降。因此在制备感受态细胞时，将细胞培养至OD
600
为
0.4
～
0.6
后放入冰浴中使其终止生 长，然后
将菌株置于低温与处理的低渗
CaCl
2
溶液中，即造成细胞膨胀， 使细胞通透性发生短暂性变化，从而极易
与外源
DNA
相黏附并在细胞表面形成复合物 。此时，将该体系转移到
42
℃下做短暂的热击（
heat
shock）
，
外源
DNA
就可能被细胞吸收。进入宿主细胞的
DNA分子通过复制、表达，实现遗传信息的转移，是宿主细
胞出现新的遗传性状。将经过转化的细胞在筛 选培养基里培养，即可筛选出转化子（
transformant
）
，即
带有 异源
DNA
分子的宿主细胞。

2+
实验十

重组质粒
DNA
的转化


外源
DNA与载体分子的连接即为
DNA
重组技术，重组的
DNA
分子式在
DNA
连接酶的作用下，有
Mg2+
、
ATP
存在的连接缓冲系统中 ，将分别经限制性内切酶酶切的载体分子和外源
DNA
分子连接起来。将重组质
粒导入 感受态细胞中，将转化后的细胞在选择性培养基中培养，可以通过各种方法筛选出重组子，并可通
过酶切 电泳进行重组子的鉴定。

三、主要仪器设备


在基因工程实验中 用到的仪器主要包括：旋涡混合器、离心机、电泳槽、烘箱、
PCR
仪、冰箱等。
< br>此外，实验中所用工具还包括常见实验工具如：离心管、移胶板、
eppendorf
管 、移液器等。

四、操作方法和实验步骤


实验一

含
GFP
基因质粒的提取

实验步骤：

1.

取菌液
0.5
～
1ml
，
1200 0r/min
离心
10
秒钟，弃上清液

2.

在旋涡混合器上振荡混匀至沉淀彻底分散

3.

加入
40 0uL
含溶菌酶的
GTE
溶液（含葡萄糖、
Tris-Hcl
缓冲液和
EDTA
），在旋涡混合器上振荡混
匀至沉淀彻底分散

4.

37
度保温
20
分钟。

5.

加酚－氯仿－异戊醇
400ul,
涡旋混匀，

6.

12000r/min
离心
5min
，将上清液移至新的离心管中。

7.

向上清液中加入
1/10
体积
(
约
40uL)
的
3mol/l
醋酸钠
(pH5.2)
，
混匀，
加入
1mL
的乙醇
（约
2
倍体
积的无水乙醇），混 匀，
-20
度静止
30min
沉淀
DNA
，取出，
12000r/min
离心
10min
。

8.

小心弃上清液，用
1mL
的
70%
乙醇洗涤沉淀，
12000r/m in
离心
5min
，弃上清，放入
55
度烘箱中
3
分钟，除去乙醇

9.

用
50uL
含
RNase A
的
TE
溶解，
37
度温浴
30min
，除去RNA
10.

取
5uL
样品进行电泳。样品贮存再
4
度冰箱中。

实验二

琼脂糖
DNA
的电泳

实验操作：

1.
称取
0.7
克的琼脂糖，加入
100ml 0.5×TBE，在微波炉上加热，使琼脂糖熔解

2.
等凝胶温度降至大约
55
℃以下时，加入
5?l 的
0.5 mg/L
溴化乙锭（
EB
）
。

3.
将移胶板放入胶室中，并将梳子垂直安插在移胶板上方，将凝胶倒入胶室中。


4
4.
等凝胶完全凝固后
(
约
30
分钟
)
，将梳子轻轻拔出。

5.
将凝胶体放入加有
0.5×TBE
电泳缓冲液的电泳槽中，并且使电泳缓冲液高出凝胶。

6.
取
2?l6×上样缓冲液与
5 ?lPCR
产物混匀后，加到凝胶孔中，

7.
加入如
3 ? l
的
l/
Hin
dIII marker*
。

8.
盖好电泳槽盖子，选择适当的电泳电压（
100V
）以及电泳方向，开 始电泳。

9.
前面色素接近胶的先端，切断电流，停止电泳，打开槽盖。

10.
取出样品，在紫外灯下观察，摄像。

实验三
PCR
扩增目的基因

实验操作

1.

取一个
0.2ml eppendorf
管，添加以下各种成分反应液

ddH2O 36.5
?l


模板
DNA 5 ?l（
100-200ng
）
*1
上游引物(10?mol/L) 1 ?l

下游引物(10?mol/L) 1 ?l

dNTP m
ixture(10mmol/L) 1?l（各
20nmol
）

10
倍×缓冲液+ MgCl2 5 ?l

Taq
酶

0.5?l （
2.5 U
）

总体积

50 ?l

2.
稍作离心
,
将反应管放入
PCR
仪中。

3.
设定反应程序：

94
℃条件下使模板
DNA
预变性
5min
。

变性
94
℃
30
秒

退火
58
℃
30
秒
30 cycles
延伸
72
℃
1.0 min
最后在
72
℃条件进行延伸
7-10min
。

4
℃保存

4.
取
5 ?l
反应液用
0.7%
琼脂糖凝胶进行电泳
,
鉴定
PCR
产物是否存在以及大小。

实验四
PCR
产物的纯化

实验操作

1.
电泳确认后将
PCR
产物移至
1.5ml
新的
epp endorf
管中。

2.
加入
200?l TE
缓冲液，加入
300 ?l
酚
/
氯仿
/
异戊醇，混匀，室温，
12000 rpm
离心
5
分钟。
*
3.
取上层水液添加
1 /10
体积（约
30?l）的
3mol/L
的
NaAc
（< br>pH5.2
）和
2.5
倍体积（约
0.75ml
）的冰冷无< br>水乙醇。

4.-20
℃冰箱中放置
30 min
以上。

5.4
℃、
12000 rpm
离心
5 min
。

6.
弃上清，添加
1 ml
的冰冷
70%
乙醇。
4
℃、
12000 rpm
离心
5 min
。

7.
弃去上清，室温干燥，30?l TE
液溶解沉淀。

实验五
DNA
的酶切反应

实验步骤：

1.

在
0.5 ml eppendorf
管中加入下列成分，（定容
40?l ）

A

5