龙口医院实验1试剂盒方法提取基因组DNA组和质粒DNA

2021年2月2日发(作者：孩子的饮食)
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实验一

试剂盒方法提取基因组
DNA
和质粒
DNA
黄华如

（生命科学学院，生技
091
，
29
号）



摘要：
实验用试剂盒方法提取
nchpzh008
植物DNA
组，本组可以在电泳图谱中清晰看到
DNA
条带，
而在用不同引物 组合来对
DNA
进行
PCR
，
在聚丙烯凝胶电泳图谱中可以看到，< br>引物组合
me4em3
、
me5em2
、
me5em3
对植物
DNA
使比较好的，这些引物组合可以用在不同物种的遗传特性分析。利用柱式试剂盒 提取
PUC18
和
500bp
质粒
DNA
，其中
1 -3
组提取
PUC18
，
4-6
组提取
500bp
质粒
DNA
。结果是提取
PUC18
质
粒
DNA
的 同学没能将质粒提取出来，而提取
500bp
的全部都可以提出来。说明了
PUC18
质粒没有成功转
化大肠杆菌，而
500bp
则转进了大肠杆菌。





关键词：
试剂盒；
DNA
基因组 ；
PCR
技术；质粒
DNA

植物细胞通常有三套基因组，
即染色体基因组、
线粒体基因组和叶绿体基因组，
其对应
的
DNA
分别称为基因组
DNA
、
线粒体
DNA
和叶绿体
DNA。
植物细胞的总
DNA
中
95%
以
上是基因组
DNA
，而且在常规提取条件下，
mtDNA
和
ctDNA
因裸露存 在，没有蛋白质的
保护，会由于提取缓冲液中酸、碱的水解而丢失。

质粒是存在于细 菌细胞中的染色体外小分子
DNA
，一般呈双链闭合环状，能自我复制
和垂直遗传，并 赋予宿主细胞一些新表性，但质粒的存在对细胞本身的存在并不是必需的。
质粒本身或经过一定改造后的 质粒常被用作基因载体，
将外源基因带入受体细胞中复制和扩
增，
甚至表达。
质粒有严谨型和松弛型之分，
基因工程研究中所用的质粒主要是松弛型质粒，
或是经过遗传修饰 的人工质粒。

DNA
提取是植物分子生物学研究的基础技术。目前，已经发展了多种 方法，成功地从
植物叶片、愈伤组织、组培苗、果实、韧皮部等组织器官中提取出
DNA
。但是有些情况下，
不同植物甚至是同一种类植物组织材料的来源、
部位、
形态等外 在性质的不同以及化学成分、
组织结构等内在特点的差异，在提取基因组
DNA
时需要 选择不同的方法或作一些特殊的处
理。从富含多糖、多酚、单宁、色素及其他次生代谢物质的木本植物中 提取的方法难度就相
对大于大多数的禾谷类及蔬菜类植物。从这些植物中分离出的
DNA
由于多酚被氧化成棕褐
色，多糖、单宁等物质与
DNA
会结合成粘稠的胶状物，获得 的
DNA
常出现产量低，质量
差、易降解，影响了
DNA
质量和纯度 ，不能被限制性内切酶酶切，严重的甚至不能作为模
板进行
PCR
扩增。用试剂盒方法 提取
DNA
组是一种比较方便和高效的方法。

1

材料与方法

1.1

试供材料





nchpfszh004
、
nchpfzh01101
、
nchpfzh01102
、农场和平
1
号、
nchpzh021
、
nchpzh008
、
大肠杆菌

1.2

试剂配制

氯仿、异丙醇、
Tris
、
Hcl
、< br>EDTA
、
75%
乙醇、灭菌水、
TBE
缓冲液、硼酸、PCR
试剂
盒、
DNA
提取试剂盒、琼脂糖等

1.3

实验设备及用具



高速冷冻离心机、液氮罐、恒温水 浴锅、紫外分光光度计、制冰机、冰箱、移液枪、
PH
计、冰盒、恒温培养箱、恒温振荡摇床、 高压灭菌锅、恒温水浴锅等。

1.4

试剂盒方法提取
DNA
组步骤

1)

65
℃预热柱式植物
DNAout
溶液
A
，使其沉淀融化，充分混匀，取
0.75ml
加入到
5ml
1
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朔料离心管中并放置
65
℃待用；

2)

称取植 物组织
0.3g
，液氮研磨后加入到
5ml
离心管中；

3)

将匀浆物全部转移到新的
1.5ml
离心管中；

4)

在匀浆液中加入
0.5
倍体积预热的溶液
B
到离心管中，
颠倒数次混匀，
此时溶液中可能
有白色丝状悬浮物产生；

5)

65
℃水浴
4min
，如果室温放置，
DN A
产量会降低
10~20%
；

6)

加入
200ul
自备氯仿，震荡混匀
20s
，此时溶液呈乳白色；

7)

12000rpm
室温离心
2min
，吸取上清液到 一个新的
1.5ml
离心管中；

8)

加入
1. 5
倍体积的溶液
C
，颠倒数次后全部转移到离心吸附柱中，室温放置至少
2m in
；

9)

将
0.5ml
通用洗柱液加入离心 柱中，
12000rpm
室温离心
1min
，弃穿透液；

10)

重复上述操作一次；

11)

空甩半分钟去除残留液体，将离心吸附柱转移到新的
1.5ml
离心管中；

12)

将离心吸附柱放置在一新的
1.5ml
管中，加
5 0ul
通用洗脱液，室温放置
5min
；

13)

12000rpm
室温离心
1min
，即得植物
DNA
溶液；
14)

由于本产品使用的离心吸附柱吸附
DNA
的能力较强 ，可以重复上步操作一次，以洗脱
得到更多的
DNA
；

15)

直接取用
5~10ul
电泳检测
DNA
，其余放冰箱待用。

1.5

柱式试剂盒方法提取质粒
DNA
步骤

1)

先将全部
RNase A
溶液全部加入到溶液
A中，摇匀后再取用，未用完的溶液
A
最好在
4
℃保存。

2)

从筛选平板上挑取单菌落至含抗生素的培养基中，
37
℃振荡 培养
12-16
小时
（摇床转速
200-300
）
。注意： 建议使用
LB
培养基，营养更丰富的培养基会使浓度过高，超过纯化
系统处理能力二降 低
DNA
质量。另外，延长培养时间有利于提高质量
DNA
浓度，但
是菌液培养过长时间会因细胞死亡、裂解而造成质粒
DNA
浓度降低。

3)

用
1.5mL
离心管收集
1-4mL
过夜培 养饱和菌液，
室温
12
，
000rpm
离心
1
分钟 ，
弃上清，
在短暂离心，吸弃残留液体。

4)

加入250uL
溶液
A
，用枪头充分吹打使菌体重悬（此步在冰上操作效果更佳）。注意：
细胞未充分悬浮会影响后续操作，
可以使用悬锅振荡器帮助混匀或使用
T ip
吸头吹打沉
淀至完全混匀。

5)

加入
25 0mL
溶液
B(
如果溶液
B
有沉淀，
用前须
37< br>℃加热溶解后冷却到室温方可使用
)
，
温和反复颠倒混匀
4-6
次，看到溶液变粘即可，然后冰上放置不超过
4-5
分钟。注意：
次步处理不能超过
5
分钟，否则
DNA
的碱损伤比较严重。同时千万不要剧烈震荡，否
则基因组
DNA
断裂产生的片段非常容易污染质粒
DNA
，形成碳酸，中和溶 液
B
中的
NaOH
，降低其效率。

6)

加入
350mL
冰上预冷的溶液
C
，反复颠倒混匀
4-6
次，可见白色沉淀物产生，然后冰
上放置至少
5
分钟。

7)

最高速（
12,000rpm
以上）
4
℃离 心
5
分钟，小心将上清液转移到离心吸附柱中。由于
此时的溶液比重较大，
有 时候出现沉淀漂浮是正常现象，
取上清时避开漂浮的沉淀即可。
如果此步的离心在室温进行，更 容易出现沉淀漂浮的现象。

8)

静置
2
分钟以上让质粒
DNA
与吸附柱充分结合，此步十分重要。

9)

室温< br>12
，
000rpm
离心
1
分钟，弃管中的废液。

10)

加入
500mL
的通用洗柱液，室温
12
，
000rpm
离心
1
分钟，弃管中的废液。注意：通用
洗柱液中含 乙醇，用后需要将盖拧紧存放，否者乙醇会挥发。

11)

重复上步
1
次。

2