上海最好的肝病医院DNA实验步骤

2021年2月2日发(作者：带状疱疹如何治疗)
实验前准备：灭菌锥形瓶，枪头，培养液，
TBE
缓冲液，
CaCl2
无菌水，
ddwater
一．
养菌
(
过夜
)

30min



1.
保存的菌种（
BL-21/TG-1
）
1ul +
ddwater
4ul
在
LB
培养皿
(
不含amp)
上划线

2.37
℃
培养
12-14h
至长出菌落。

3.
摇菌无菌
锥形瓶
内加入
6-7ml
LB
培养 液，挑取单菌落加入培养液中，
37
℃
，
200rpm
摇菌
12-14h



二．感受态细胞制备


(15min+
恢复
2.5h+2h)5h


CaCl2
配制：
2.205g
CaCl2`H2O

+

ddwater

149.5ml

灭菌水


冰箱保存

1
．前夜接种锥形瓶培养液
2ml


+

25ml
培养液的锥形瓶



37
℃摇床培养


2-2.5h
（取
1ml
过夜培养物——
100ml LB
培养液


37
℃摇菌
2.5-3
小时（
250-300rpm）
；
）

3
．将
0.1M CaCl2
溶液置于冰上预冷；

4
．
1.5ml
菌液至
1.5ml
离心管



冰上冷却
10-15
分钟；

5
．
4
℃下
6
000 rpm
冷冻离心
5
分钟；
(
3000rpm 10 min)

重复三次

6
．弃去上清，加入
100μl
预冷
0.1M CaCl2
溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新
悬浮，在冰放置
20
分钟；

7
．
4
℃下
6000 rpm
冷冻离心
5
分钟；

8
．弃去上清，加入
2
00μl
预冷
0.1M CaCl2
溶液，超低温冷冻贮存备用（－
70
℃）
。


三．转化


2.5h





（
1
）加入
2ul
质粒
DNA
溶液（含 量不超过
50ng
，体积不超
过
10μl
）
+
5
0μl
（稀释）感受态细胞
= 1.5ml
离心管

冰浴
40
分钟

（
2
）
42
℃
水浴浴锅
80
秒

冰上冷却
2-3
分钟

（
3
）

培养液（不含
Amp
）
650
微升

（瓶口灭菌）

（
4
）摇菌
30
分钟
200-250
转

（
5
）离心

1
分钟
5000
转
（直接取
100
微升菌液接种）

（
6
）去上清液，留少许

混匀

（
7
）接种环
+
培养皿含
Amp
的筛选平板

生化培养箱
35.1
℃

（
8
）生出菌

（
9
）
枪头取菌
+
含有
AMP
的
10
毫升
培养液

锥形瓶
（瓶口灭菌）摇菌
12-14
小时
250
转

37
℃



三
.

提取质粒

离心管
1-2h
（
1
）菌
1500
微升

离心
1
分钟
，
5000rpm
弃上清液（重复一次）

（
2
）
250
微升

溶液Ⅰ悬浮液（
冰
）——打散菌块

（
3
）
250
微升

溶液Ⅱ

裂解液

放置小于
5
分钟

颠倒
4-5
次

（
4
）
350
微升

溶液Ⅲ

结合液

放置小于
10
分钟

颠倒
4-5
次

（
5
）
13000rpm
离心
10
分钟

准备
纯化柱

（
6
）换纯化柱离心
30-60
秒

弃清液

（
7
）缴入
750
微升溶液Ⅳ

洗涤液

离心
30-60
秒

（洗去杂质，弃液体）

（
8
）离心
1
分钟

去残留的液体