上海复旦大学附属分子生物学实验报告

2021年2月2日发(作者：痔疮术后)






分子生物学实验








院系：生命科学与技术学院




专业：




班级：




学号：




姓名：









生物科学（基地）






201101
班

































































































分子生物学基础实验

分子生物学实验技术已成为生物化学及分子生物学以 及相关学科院系教学科研不可缺
少的一部分。为提高学生在分子生物学技术方面的动手能力，生物技术综 合实验室主要开
设常用而基本的分子生物学实验技术。
它的内容包括质粒
DNA
的制备；
DNA
的重组；
PCR
基因扩增等等。






实验一


质粒
DNA
的小量制备

一、实验原理



要把一个有用的外源基因通过基因工程手段，送进细胞中去进行繁殖和表达，需要运载
工具，携带外源基因进入受体细胞的这种工具就叫载体（
vector
）
。载体的设 计和应用是
DNA
体外重组的重要条件。作为基因工程的载体必须具备下列条件
:(1 )
是一个复制子，载
体有复制点才能使与它结合的外源基因复制繁殖；
（
2< br>）载体在受体细胞中能大量增殖，只
有高复制率才能使外源基因在受体细胞中大量扩增；
（
3
）载体
DNA
链上有
1
到几个限制
性内切酶的 单一识别与切割位点，
便于外源基因的插入；
（
4
）
载体具有选择性 的遗传标记，
如有抗四环素基因（
Tc
r
）
，抗新霉素基因（
Ne
r
）等，以此知道它是否已进入受体细胞，也
可根据这个标记将受体细胞从其他 细胞中分离筛选出来。细菌质粒具备上述条件，它是基
因工程中常用的载体之一。

质 粒（
plasmid
）是一种染色体外的稳定遗传因子，大小在
1
～
120kb
之间，具有双
链闭合环状结构的
DNA
分子，
主要发现于 细菌、
放线菌和真菌细胞中。
质粒具有自主复制
和转录能力，能使子代细胞保持它们恒 定的拷贝数，可表达它携带的遗传信息。它可独立
游离在细胞质内，也可以整合到细菌染色体中，它离开 宿主的细胞就不能存活，而它控制
的许多生物学功能也是对宿主细胞的补偿。

质粒在细胞内的复制，一般分为两种类型：严密控制型（
stringent control
）和松弛
控制型（
relaxed
control
）
。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制，染色体不复制时，
它也不复制。每个细胞内只含有
1
个或几个质粒分子。后者的质粒在整个细胞周期中随时
复制，在细胞里，它有许多拷 贝，一般在
20
个以上。通常大的质粒如
F
因子等，拷贝数
较少，复 制受到严格控制。小的质粒，如
ColE
Ⅰ质粒（含有产生大肠杆菌素
E1
基因）
，
拷贝数较多，
复制不受严格控制。
在使用蛋白质合成抑制剂－氯霉素 时，
染色体
DNA
复制
受阻，而松弛型
ColE
Ⅰ质粒继续 复制
12
－
16h
，由原来
20
多个拷贝可扩增至
1000
－
3000
个拷贝，此时质粒
DNA
占总
DNA< br>的含量由原来的
2
％增加到
40
％－
50
％。本实< br>验分离提纯化的质粒
pBR322
、
pUC19
就是由
Col E
Ⅰ衍生的质粒。

所有分离质粒
DNA
的方法都包括三个基本步 骤
:
培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细


菌；分离和纯化质粒< br>DNA
。采用溶菌酶可破坏菌体细胞壁，十二烷基硫酸钠（
SDS
）可使
细胞壁解，经溶菌酶和阴离子去污剂（
SDS
）处理后，细菌染色体
DNA
缠绕附着在细胞
壁碎片上，离心时易被沉淀出来，而质粒
DNA
则留在清液中。用乙醇 沉淀、洗涤，可得到
质粒
DNA
。

质粒
DNA
的 相对分子量一般在
10
6
－
10
7
范围内，如质粒
pBR322
的相对分子质量
为
2.8×
10
6
，质粒pUC19
的相对分子质量为
1.7×
10
6
。在细胞内，共价 闭环
DNA
（
covalently closed circular DNA，简称
cccDNA
）常以超螺旋形式存在。如果两条链
中有一条链发生一处或多 处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，这种松弛型的分子叫做
开环
DNA
（
open
circular
DNA
，简称
ocDNA
）
。在电泳时，同一质粒如以
cccDNA
形
式存在，它比其开环和线状
DNA
的泳动速度快，因此在本实验中，自制质粒
DNA
在电泳
凝胶中呈现
3
条区带。


二、实验目的

1
．掌握最常用的提取质粒
DNA
的方法和检测方法。

2
．了解制备原理及各种试剂的作用。


三、实验材料和试剂

材料：大肠杆菌

，含
pBR322
质粒。

试剂：

1.

LB
培养基：
10g/L
胰蛋白胨，
5g/L
酵母提取物，
10g/L
NaCl
，用
NaOH
调
pH
至
7.3
左右。如固体培养基则添加
15 g/L
琼脂。

2.

溶液Ⅰ
（
pH8.0G.E.T
缓冲液）
：
50 mmol/L
葡萄糖，
25mmol/LTris- HCl
，
10mmol/L
EDTA
。灭菌后存放。

3.

溶液Ⅱ
（
0.2mol/LNaOH(
内含
1
％
SDS)
）
：
预先配制
1
％
SDS< br>母液，临用前一天晚上
加入
0.2mol/LNaOH
，
4
℃ 保存。

4.

溶液Ⅲ（
pH4.8
乙酸钾溶液）
：
5mol/L
乙酸钾
60mL
、冰乙酸
11.5mL
、双 蒸馏水
28.5mL
。

5.

酚
/
氯仿 液
(V/V
＝
1/1)
：酚为重蒸酚，配制时，先将氯仿中加入异戊醇，使其 体积比为
24:1
，然后等量的加入重蒸酚，
混匀，并用
0.1mol/LT ris-HCl (pH7.6)
抽提几次以平
衡这一混合物，
于棕色瓶中存放，并在上面覆盖等体积的
0.01 mol/LTris- HCl(pH7.6)
，
4
℃保存。

6.

无水乙醇



7.

70
％乙醇

8.

pH8.0 TE
缓冲液：
10mmol/LTris-HCl
、
1mmol/LEDTA
，
其中含
RNA
酶
20μg/mL
。

仪器：

恒温培养箱、恒温摇床、超净工作台、高压蒸汽灭菌锅、台式高速离心机、台 式小型振
荡器、
EP
管
(1.5mL
微量离心管
)
、加样器
(20uL
～
lmL)
、吸头。



四、操作步骤

（一）培养细菌

将带有质粒
pBR322
的大肠杆菌接种在含
50μg/mL
氨苄青霉素
(Amp)
的
LB
液体培
养基中，
37
℃振荡培养过夜。注意：添加
Amp时，须待
LB
培养基冷却到
50
℃左右方可
加入。

（二）从菌落中快速提取制备质粒
DNA
1
．取
1.4mL
菌液置于
1.5mL Ep
管中，
7500rpm
离心
1min
。

2
．
弃上清，
加入
150μL

GET
缓冲液，
在涡旋混合器上充分混匀，
在室温下放置
10min
。

3
．加入
200μL
新配制的
0.2mol/L NaOH(
内含
1
％
SDS)
，加盖，颠倒（不要振荡）
2
～
3
次，使之混匀，冰上放置
4min
，最多不能超过
5min
。< br>
4
．加入
150μL
冰冷的乙酸钾溶液。加盖后，颠倒数次使之混匀 ，冰上放置
15min
。

5
．
10000rpm
离心
5min
，上清液吸至另一干净的
1.5mL
Ep
中，如上清液浑浊则需重
新离心一次。

6
．
于上清液中加等体积酚
/
氯仿液，
振荡混匀，
12000rpm
离心
2min
，
小心吸取上清液，
转移至另一
1.5mL Ep
管中，注意勿将两液相中间的白色蛋白薄层吸出。

7
．向上清液加入< br>2
倍体积无水乙醇，混匀，室温放置３
min
。用离心机于
10000 rpm
离
心
5min
。倒去上清液。

8
．用
0.5mL
70
％乙醇洗涤沉淀一次，
10000 rpm
离心
3min
，除尽乙醇，室温自然干
燥
(
将离心管 倒置于一张纸巾上
)
，备用。

9
．
用
30uL< br>含无
DNA
酶的胰
RNase(20 ug
／
mL)
的
TE
重新溶解
DNA
，
置于
4
℃保存，
供下午电泳使用。


这里因为要检测质粒是否提取成功以及提取质粒的浓度，故在此 要进行一次电泳，下
面为琼脂糖凝胶电泳的原理及方法：

原理：
根据
DNA
分子量不同，采用外加电场使其分开，用
EB
嵌入
DNA
分 子后在紫外下


显荧光。
而荧光强度正比于
DNA
的含量 ，
如将已知浓度的标准样品表
2
－
1
作为电泳对照，
就可以 估计出待测样品的浓度。电泳后的琼脂凝胶糖直接在紫外灯下拍照，只需要
5
－
10n gDNA
，就可以从照片上比较鉴别。

由于电泳时所用的样品量非常少，只要将浓度 控制在几十纳克即可，所以在基因工程
中经常被用做检测
DNA
样品。

表
2
－
1

λDNA/
Hind
Ⅲ中
DNA
片断

片段

碱基对数目
/kb
相对分子质量

DNA
含量
/ %
DNA
含量
/(ng/mg)
1
2
3
4
5
6
7
8
23.130
9.419
6.557
4.371
2.322
2.028
0.564
0.125
15.0×
10
6

6.12×
10
6

4.26×
10
6

2.84×
10
6

1.51×
10
6

1.32×
10
6

0.37×
10
6

0.08×
10
6

47.7
19.4
13.5
9
4.8
4.2
1.1
0.3
476.9
194.1
135.2
89.9
47.9
41.8
11.6
2.6
总
DNA
含量为
100%

琼脂糖凝胶板的制备

1
．琼脂糖凝胶的制备

称取
1.0g
琼脂糖，置于锥形瓶中，加入
100mL TBE
缓冲 液，于电炉上加热，注意：
防止溢出，由于琼脂糖较难溶解，如果水分损失较大，则补充一定量的蒸馏水 ，使其终浓
度为
1
％。

2
．胶板的制备

将有机玻璃内槽洗净、晾干。取胶带纸将有机玻璃内槽的两端边缘封好，形成一个边
脚模子。注意：将 橡皮膏紧贴在有机玻璃内槽两端边上，不能留空隙。

将有机玻璃内槽置于水平位置，放好样品 槽模板
(
一般称之为梳子
)
，将冷却至
65
℃左
右 的琼脂糖凝胶，小心地倒在内槽上，控制灌胶速度，使胶液缓慢地展开，直到整个有机
玻璃板表面形成均 匀的胶层。室温下静置
1h
左右，待凝固完全后，轻轻拔出样品槽模板，
撕去胶带纸， 胶板上即形成相互隔开的样品槽。



将有机玻璃内槽放入电泳槽中，加入
0.5×
TBE
电泳缓冲液，以盖过胶板为宜。


胶板内的样品小槽

3
．加样

用移液枪将上述样品分别加 入胶板的样品小槽内，每次加完一个样品为了避免交叉污
染，各样品用不同的枪头，以免造成限制酶被污 染。加样时，枪头不要插入胶板内，防止
碰坏样品槽周围的凝胶面，每个样品槽的加样量不宜过多，本实 验加样为
10uL
左右。
(
每
块胶板需点一个
Marker
，这里即为
λDNA/
Hind
Ⅲ
)
4
．电泳

加完样品后应立即通电，
进行恒压电泳。
在低压 条件下，
线形
DNA
片段的迁移速度与
电压成比例关系，
为了获得电 泳分离
DNA
片段的最大分辨率，
电场强度不应高于
5V/cm
。< br>
当溴酚蓝染料（蓝色）移动到距离胶板下沿约
1
～
2cm
处 ，停止电泳。

5
．染色

将电泳后的凝胶浸入
EB
染液中，进行染色以观察在琼脂糖凝胶中的
DNA
带。染色
20min
后， 用大量水冲洗。

6
．观察

在波长为
254nm
的紫外灯下，观察染色后的电泳凝胶。
DNA
存在处显示出红色荧光
条带。用凝胶自动 成像仪处理代替。


五、注意事项

1
．收集菌体提质粒前，培养基要去除干净，同时保证菌体在悬浮液中充分悬浮。
< br>2
．在添加溶液Ⅱ与溶液Ⅲ后溶液的混合一定要柔和，
采用上下颠倒的方法，
千 万不能在旋
转器上剧烈振荡。其中加入溶液Ⅱ后，溶液变成澄清，并有黏性；加入溶液Ⅲ后，出现
絮状沉淀。

3
．苯酚具有腐蚀性，能造成皮肤的严重烧伤及衣物损坏，使用时应注 意。如不小心皮肤上
碰到苯酚则应用碱性溶液、肥皂及大量的清水冲洗。

4
．苯酚可以用于抽提纯化
DNA
，由于苯酚的氧化产物可以使核酸链发生断裂。所使用的
苯酚在使用前必须经过重蒸，且都必须用
0.1mol/LTris-HCl (pH7.6)
进行平衡。所以


取酚
/
氯仿
/
异戊醇时应取下层溶液，因为上层是
Tris-HCl
液隔绝空气层。
5
．酚
/
氯仿
/
异戊醇抽提时，应充分混匀。经酚
/< br>氯仿
/
异戊醇抽提后，吸取上清液时注意不
要把中间的白色层吸入，其中含有蛋 白质等杂质。

6
．
实验中，
涉及酚
/
氯仿溶液的 操作要格外小心，
而且与之接触的吸头、
Ep
管，
全部弃用，
不回收 。

7
．有些质粒本身可能在某些菌种中稳定存在，但经过多次移接有可能造成质粒丢 失。
因此
不要频繁转接，每次接种时应挑单菌落。


六、实验结果与分析

提取质粒
DNA
后，经琼脂糖凝胶电泳，图谱如下：

图中
M
为
Marker
，
4
号为本人所提取的质粒
DNA
凝胶电泳的检测图，本人所用的质粒为
pEGFP-N3
。由跑胶结果可知，质粒
D NA
分子
条带较为明亮，说明所提取的
DNA
浓度很高；
前面原理部 分提到，
质粒
DNA
分子的结构多样，
包括超螺旋结构，开环结构以及线性结 构等，它
们在凝胶中的泳动速度不同，所以在图谱中显示
有多条带；胶孔中比较亮的部分表明提 取的质粒
中有大量蛋白质残留；条带非常宽而且两侧有轻
微的拖尾迹象表明点样时样品量加的过 多，在质
粒检测中可以适当减少加样量，使得条带清晰均
匀一点。一般在实验室中，不会单独检 测质粒
DNA
，或者检测质粒
DNA
时不用
Marker
， 这
主要是因为质粒
DNA
分子结构多样，在电泳图
谱中并不能够正确显示其大 小。


七、思考题

1
．裂解细菌时需注意的事项有哪些？

答：
首先注意的是
SDS- NaOH
处理的时间。
质粒制备过程中，
如果质粒长时间暴露于
NaOH,
质
粒有可能不可逆变性，使得抽提质粒中有部分是变性质粒。这些变性质粒，不能酶切。所有一般情况下，
SDS-KOH
处理时间不能超过
5
分钟，
最好 在冰里处理，
观察到液体变得清就
可以加入中和液。其次是在添加溶液Ⅱ与溶液Ⅲ后溶液的混合 一定要柔和，采用上下颠倒


的方法，
千万不能在旋转器上剧烈振荡，否则会是质粒
DNA
断裂，
影响提取的效果与浓度。

2
．质粒的基本性质有哪些？

答：
质粒是一种染色体外的稳定遗传 因子，
是双链闭合环状结构的
DNA
分子；
具有自主复
制和转录能力 ；可独立游离在细胞质内，也可以整合到细菌染色体中。

3
．碱裂解法提取质粒
DNA
中各溶液的作用是什么？

答：
溶液Ｉ
:pH8.0
GET
缓冲液
，葡萄糖的作用是 使悬浮后的大肠杆菌不会很快沉积到管
EP
的底部，增加溶液的粘度，维持渗透压及防止
DNA
受机械剪切力作用而降解。
EDTA
是
Ca
2
＋

和
Mg
2
＋

等二价金属离子的螯合剂，
在溶液< br>I
中加入
EDTA
，
是要把大肠杆菌细胞中的二价
金属离子都 螯合掉。从而起到抑制
DNase
对
DNA
的降解和抑制微生物生长的作用。

溶液Ⅱ：
0.2mol/LNaOH(
内含
1%
的
SDS)
，
NaOH
是最佳溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还
是哺乳动物 细胞，碰到了碱都会在瞬间溶解，这是由于细胞膜发生了从
bilayer
（双层膜）
结构向
micelle
（微囊）结构的相变化。
SDS
是离子型表面活性剂。 它主要作用是：
a
溶解
细胞膜上的脂质与蛋白，从而破坏细胞膜。
b
解聚细胞中的核蛋白。
c
能与蛋白质结合成为
R-O-SO
3
-< br>…R＋
-
蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。
SDS
能抑制核 糖核酸酶的作
用，所以在接下来的提取过程必须把它去除干净，以便下一步试验的更好进行。

溶液Ⅲ：
pH4.8
乙酸钾溶液，
pH4.8
的乙酸钾溶液是为了把 抽提液的
pH
调至中性，从而使
变性的质粒
DNA
复性，
且 稳定存在。
溶液
III
加入后的沉淀实际上是
K
+

置换了
SDS
中的
Na
+

形成了不溶性的
PDS
，
而高浓度的盐有利于变性的大分子染色体
DNA
、
RNA
以及
SDS
-

蛋白复
合物凝聚，使得沉淀更完全。前者是 因为中和核酸上的电荷，减少相斥力而互相聚合，后
者是因为盐与
SDS
－蛋白复合物 作用后，能形成较小的盐形式复合物。

酚
/
氯仿液
(V/V
＝
1/1)
：用苯酚处理时，能使蛋白质变性，同时抑制了
DNase
的降 解
作用，由于蛋白与
DNA
联结键已断，蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似 相溶，
蛋白分子溶于酚相，而
DNA
溶于水相，使用酚能有效变性蛋白质，抑制了DNase
的降解
作用；氯仿能克服酚的缺点，加速有机相与液相分层，去除核酸溶液中的 迹量酚（酚易溶
于氯仿中）
；异戊醇的作用是减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡，异戊醇可 以降低表面
张力，
从而减少气泡产生，
另外，
异戊醇有助于分相，
使 离心后的上层含质粒
DNA
的水相、
中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。< br>
无水乙醇：
乙醇可以以任意比和水相混溶，而
DNA
溶液是
DNA
以水合状态稳定存在，同时
乙醇与核酸不起化学反应，因此是理想的沉淀剂。加入乙醇后 ，乙醇会夺去
DNA
周围的水
分子，
DNA
失水聚合。

70%
乙醇：
将质粒
DNA
表面的离子洗去。

pH 8.0 TE
缓冲液：
由于缓冲液是
TrisH
+
/Tris
，不存在金属离子的干扰作用，而
TE
缓冲


液中的
EDTA
更能稳定
DNA
的活性。酚与水有一定的互溶，苯酚用水饱和 的目的是使其抽提
DNA
过程中，不致吸收样品中含有
DNA
的水分，减少< br>DNA
的损失。用
Tris
调节至
pH
为
8
是因为
DNA
在此条件下比较稳定。在中性或碱性条件下（
pH5
～
7
）
，
RNA
比
DNA
更容易游离
到水相，所以可 获得
RNA
含量较少的
DNA
样品。

4.

抽提质粒
DNA
的方法包括哪几个步骤？

答：
DNA提取分为三个基本步骤：
1
、破碎细菌细胞壁，加入去污剂除掉膜脂从而裂解细
胞 ，使蛋白质与
DNA
变性，利用醋酸盐沉淀基因组
DNA
、细胞碎片与蛋白质 。
2
、酚
/
氯
仿抽提，
以除掉细胞内的蛋白。
3< br>、将
DNA
在冰乙醇中沉淀，因为乙醇与水互溶，而
DNA
在醇中不可 溶而黏在一起，这一步也能除掉盐分。

5.

如何提高质粒
DNA
的产量？

答：第一是扩大质粒
DNA
的拷贝数，一般认为，培养
16
小时的菌液状态最好，最适合提
取，
可以在此基础上扩大接种量，
等比例扩大
LB
培养基的体积，
采取多次抽提的 方法提高
质粒
DNA
的产量；第二是在提取过程中小心谨慎，在加入苯酚
/< br>氯仿溶液离心之后小心吸
取的同时尽量吸取完全，减少损失。

6.

为什么质粒
DNA
不能反复在
4
℃、
-20
℃、室 温中放置？为达到这一目的，需要注意
些什么？

答：当质粒存放在
-20< br>℃的条件下保存时，由于
TE
缓冲液中含有水分，会结成冰晶插入到
质粒
DNA
分子的间隙中，而在
4
℃条件下不会出现这种状况。若是质粒
DNA
分子反复冻
溶，水溶液的反复结冰会导致环状
DNA
分子断裂，导致得到线性 的质粒
DNA
，在接下来
的实验中将会影响到酶切与检测。
为了保护质粒DNA
分子不受到损害，
应当将近期需要使
用的质粒存放于
4
℃ 冰箱保存，
方便使用，
而对于暂时不用的质粒，
则应存放于
-20
℃ 冰箱，
长期保存。