洛阳人流实验一 大肠杆菌基因组提取

2021年2月2日发(作者：护肤知识)
在实验开始，首先对实验的一些必须步骤（注：在几乎每一次小实验都会使用
到的试验方法）做 一定的解释。避免在写实验报告的过程中太过混乱！并且这
些过程并不是每一位同学都参与了的，故在本 实验报告的开篇写出。

（一）制备
1%
的琼脂糖凝胶

称取
1g
琼脂糖，
放入锥形瓶中，
加入
100 mL
的
1 ×
TAE
缓冲液，
在微波炉
中加热。完全融化后，取出摇匀。

（二）胶板的制备

1.
用橡皮膏将胶板的两端边缘封闭好。

2.
将胶板放在水平处，放好样品梳子。





3.
将冷却到
60
℃左右的琼脂糖凝胶缓慢倒入胶板中，注意不 要产生气泡。
胶的厚度在
3-5mm
之间。

4.
待胶凝 固后，取出梳子，取下橡皮膏，放入电泳槽内（注意：梳子的方
向靠近负极）
。

5.
向电泳槽中加入
1 ×
TAE
缓冲液，缓冲液要浸没凝胶。

（三）加样

1.
在样品中加入适量的
10 ×
上样缓冲液，使缓冲液的终浓度为
1×
。





2.
用微量移液器将已加入缓冲液的样品加入上样孔中。记录加样的顺序和
加样量。
（注意：加样的过程中不要让样品溢出上样孔）

（四）电泳





1.
接通电泳槽与电泳仪的电源
（注意
DNA
片段是从负极向正极移动）
。
DNA
的迁移速度与电压成正比 。最高电压不超过
5V/cm
。

2.
当溴酚蓝染料移动到凝胶的
2/3
处时，停止电泳。

（五）染色

将电泳后的凝胶浸入溴化乙锭染色液中（带手套操作）
。

（六）观察实验结果

在紫外灯（
360 nm
或
254 nm
）
下观察染色后的凝胶，
DNA
处显出橘红色的
荧光条带。

实验一

大肠杆菌基因组提取

【实验目的】

1.
学习并掌握细菌基因组的提取方法

【实验原理】

DNA
是一个环形的大分子
DNA,
真核生 物的
DNA
是以染色体的形式存在于细胞
核内。不同种属的生物，以及不同形式的细胞 （如菌类、培养细胞、植物组织，
动物组织）基因组提取的方法是不同的，但其基本原则是类似的，即既 要将
DNA
与蛋白质、
脂类和糖类等分离，
又要保持
DNA
分子的完整。
提取
DNA
的一般过程
是将分散好的组织细胞在含十二烷基硫酸 钠（
SDS
）和蛋白酶
K
的溶液中消化分
解蛋白质，再用酚和氯仿< br>/
异戊醇抽提分离蛋白质，得到的
DNA
溶液经乙醇沉淀
使
D NA
从溶液中析出。
SDS
的作用机理是由于其能结合蛋白，中和蛋白的电性，
使蛋白质的非共价键受到破坏，
失去二级结构，
从而变形失活，
蛋白酶
K< br>的重要
特性是能在
SDS
和
EDTA
（乙二胺四乙酸二钠）存 在的情况下保持很高的活性。
在匀浆后提取
DNA
的反应体系中，
SDS可通过失活蛋白破坏细胞膜、核膜，并使
组织蛋白与
DNA
分离；
而蛋白 酶
K
可将蛋白质降解成小肽或氨基酸，
使
DNA
分子
完整地 分离出来。
CTAB(
十六烷基三乙基溴化铵
)
是一种去污剂，可溶解细胞膜 ，
它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（
（
0.7 mol/L NaCl
）是可溶的，当降低
溶液盐浓度到一定程度（
0.3
mol/L
NaCl
）时，从溶液中沉淀，通过离心就可将
CTAB-
核酸的复合物与蛋 白，多糖类物质分开。最后通过乙醇或异丙醇沉淀
DNA
，
而
CTAB
溶于乙醇或异丙醇而除去。

【实验材料】


大肠杆菌
DH5
α
菌液

【实验试剂】


LB
液体培养基，
TE
溶液，
10%SDS
，蛋白酶
K
，
5mol/L NaCl
，
CTAB/NaCl
溶液，酚< br>/
氯仿
/
异戊醇，异丙醇，
70%
乙醇

【实验仪器与用具】


微量移液器，低温离心机，水浴锅，
eppendorf
管，恒温摇床

【实验步骤】


（
1
）将
2mL
培养至对数期的大肠杆菌
DH5
α
菌液
5000rpm
冷冻离心10min
弃上清；


（
2
）加
190
μ
L
TE
悬浮沉淀，并加
10
μ
L
10%SDS
，
1
μ
L
20mg/mL
蛋白酶< br>K
，
混匀，
37
℃保温
1h
；


（
3
）加
30
μ
L 5mol/L NaCl
，混匀；


（
4
）加
30
μ
L CTAB/NaCl
溶液，混匀，
65
℃保温
20min
；


（
5
）
加入
300
μ
L
酚
/
氯仿
/
异戊醇
（
25
：
24
：
1
）
抽提，
5000rpm
离心
10min
，< br>将上清液移至干净离心管；


（
6
）加入
3 00
μ
L
氯仿
/
异戊醇（
24
：
1
）抽提，取上清液移至干净管中；


（
7
）加
3 00
μ
L
异丙醇，颠倒混合，室温下静止
10min
，沉淀
DNA
；


（
8
）
5000rpm
离心
10min
，沉淀
DNA
，加入
500
μ
L 70%
乙醇，
5000rpm
离心
10min
，弃乙醇，吸干；

（
9
）
溶解于
20
μ
LT E
，
取
3
μ
L
用于琼脂糖凝胶电泳验证，
其余
-20
℃保存。

【实验结果与分析】

10 9 8 7 6 M

如 图所示，
8
号为本组实验结果。
对比
maker,
第一条带为正常大 肠杆菌基因
组，
中间可以看见模糊的两条带，
可能为断裂的基因组片段，
下面 最亮的为
RNA
。
出现断裂的基因组可能是由于操作过于剧烈。
本组电泳带还 比较清晰整齐，
其他
组不整齐的带可能是电泳技术问题。
RNA
含量很大，所 以出现拖尾现象。


实验二

大肠杆菌感受态细胞的制备及验证

【实验目的】

1.
掌握感受态的制备和转化的原理

2.
学习大肠杆菌感受态细胞的制备方法

3.
为重组子的转化做准备

【实验原理】

本实验采用
C aCl
2
制备大肠杆菌的感受态细胞。
所谓的感受态，
即指受体
（或
者宿主）
最易接受外源
DNA
片段并实现其转化的一种生理状态，
它 是由受体菌的
遗传性状所决定的，同时也受菌龄、外界环境因子的影响。
Ca
2+也可大大促进转
化的作用。
细胞的感受态一般出现在对数生长期，
新鲜幼嫩的细胞 是制备感受态
细胞和进行成功转化的关键。
制备出的感受态细胞暂时不用时，
可加入占 总体积
15%
的无菌甘油或
-70
℃保存。

在基因克隆技 术中，
转化特指将质粒
DNA
或以其为载体构建的重组
DNA
导入< br>细菌体内，使之获得新的遗传特性的一种方法。它是
微生物
遗传、分子遗传、基
因工程等研究领域的基本实验技术之一。

受体细胞经过一些特殊方法（如：电击法，
CaCl
2
等化学试剂法）处理后，
使细胞膜的通透性发生变化，
成为能容许 外源
DNA
分子通过的感受态细胞。
进入
细胞的
DNA
分子 通过复制、
表达实现遗传信息的转移，
使受体细胞出现新的遗传
性状。
大肠杆菌的转化常用化学法（
CaCl
2
法）。其原理是细菌处于
0℃，
CaCl
2
的
低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA
形成抗
DNase
（
DNA
酶）
的羟基
--
钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经
42
℃短时间热冲击处理，促使细胞
吸 收
DNA
复合物，
在丰富培养基上生长数小时后，
球状细胞复原并分裂增值。
被
转化的细菌中，
重组子中基因得到表达，
在选择性培养基平板上，
可选出所需的
转化子。

【实验材料】


大肠杆菌
DH5
α

【实验试剂】


LB
液体培养基，
0.1mol/Lcacl
2
溶液

【实验器材】


恒温摇床，超净工作台，高压灭菌锅，低温离心机，微量移液器

【实验步骤】


一、感受态细胞的制备

1.
将冻存的菌种
1
：
100
接种于
3ml
的LB
液体培养基中，
37
℃摇床过夜震荡
培养。

2.
取
1ml
活化菌种接种于
100mlLB
培养基中，
3 7
℃摇床培养
1.5-2h
。

3.
将菌种在冰上 放置
10min
。
4
℃、
4000rpm
下离心
1 0min
收集菌体。

4.
弃上清，用事先冰浴的
0.1m ol/Lcacl
2
重新悬浮细胞，冰浴
30min
。

5.
收集菌体，条件同上。

6.
弃上清，在冰浴条件下加入
0.1mol/Lcacl
2
溶液。

7.
分装保存（
40%
甘油与感受态细胞
1
：1
混合，使甘油的终浓度为
20%
）。


二、验证


（一）制备含
Amp
的蓝白斑筛选琼脂平板


固体培养基融化后，
待冷却到
60
℃

左右，
加入氨苄青霉素
（工作浓度
为
100
?
g/mL
）
，混匀，倒入培养皿中。

2.
培养基凝固后，在琼脂平板上加入
40
?L
的
20 mg/mL
的
X-Gal
和
4
?L
的
200 mg/mLIPTG
溶液，
用涂布器涂匀。
避光保存
3h
，以利于
IPTG
和
X-Gal
的
吸收。


（二）重组子的转化

1.
取
200
?L甘油保存的感受态细胞，低温融化后，加入
1
?L
的重组
质粒（
DNA > 50ng
）
，混匀，冰上放置
30 min
。

同时做两个对照：

（
1
）阴性对照：
200
?L
感受态细胞，不加任何质粒
DNA
。

（
2
）阳性对照：
200
?L
感受态细胞，加入不带外源
DNA
的空载体。

2.
将转化的混合物立即放入
42
℃

循环水浴中
90sec
（注意：不要晃动）
。

3.
然后冰浴
2 min
。

4.
在转化子中 加入
600
?L
不含
Amp
的
LB
液体培养基，< br>37
℃

摇床培养
1h
（
慢
摇）
。

5. 4000 rpm
离心
5 min
，沉淀细菌细胞。

6.
用微量移液器去除上清溶液
600
?L。

7.
将沉淀 与剩余的上清混匀，涂在制备好的含
Amp
的琼脂平板上。阴性对
照的转化混合物，< br>一部分涂于含
Amp
的琼脂平板，
一部分涂于不含
Amp
的琼 脂平
板上，以检测感受态细胞是否污染。

8.
待菌液完全被吸收后，
37
℃

倒置培养
12-16 h
。

【实验结果与分析】

实验结果：


感受态细胞制备成功，
而且转化效率比较高。
阴性对照没有出现菌落，
结果< br>正常。

分析以及讨论：


感受态细胞转化效率的影响因素


（
1
）
细胞的生长状态和密度

最好从
-70℃或
-20
℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌
液。不要用已经 过多次转接，及贮存在
4
℃的培养菌液。细胞生长密度以每毫升
培养液中的细胞数在< br>5
×
10
7
个左右为佳。即应用对数期或对数生长前期的细菌，
可通过测定培养液的
OD
600
控制。对
TG1
菌株，
O D
600
为
0
．
5
时，细胞密度在
5
×
10
7
个
/ml
左右。（应注意
OD
600
值与细胞数之间的关系随菌株的不同而不同）。
密度过高或不足均会使转化率下降。

此外，受体细胞一般应是限制
-
修饰系统缺陷的突变株，即不含限制性内切
酶和甲基 化酶的突变株。并且受体细胞还应与所转化的载体性质相匹配。


（
2
）质粒
DNA
的质量和浓度

用于转化的质粒
DNA
应主要是超螺旋态的，
转化率与外源
DNA
的浓度在一定范围内成正比，
但当加入的外源
DNA
的量过多或体积过大时，
则会使转 化率下降。
一般地，
DNA
溶液的体积不应超过感受态细胞体积的
5%
，
1ng
的
cccDNA
即可使
50ul
的感受态细胞达 到饱和。

对于以质粒为载体的重组分子而言，
分子量大的转化效率低，
实验 证明，
大
于
30kb
的重组质粒将很难进行转化。此外，重组
DNA
分子的构型与转化效率也
密切相关，环状重组质粒的转化率较分子量相同的线性重组质粒高10--100
倍，
因此重组
DNA
大都构成环状双螺旋分子。


（
3
）
试剂的质量

所用的
Ca Cl
2
等试剂均需是最高纯度的，并用最纯净的水配制，最好分装保
存于
4< br>℃。


（
4
）防止杂菌和杂
DNA
的污染

整个操作过程 均应在无菌条件下进行，
所用器皿，
如离心管，
移液枪头等最
好是新的，并经 高压灭菌处理。所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂、
DNA
酶或杂
DNA< br>所污染，否则均会影响转化效率或杂
DNA
的转入。


（
5
）
整个操作均需在冰上进行，
不能离开冰浴，
否则细胞转化率 将会降低。


实验三

重组子的制备和转化

【实验目的】

1.
掌握
PCR
，回收与连接的原理

2.
掌握重组质粒制备的方法

【实验原理】

（一）
PCR
原理


聚合酶链反应（
polymerase chain reaction
，
PCR
）是一种体外
DNA
扩增技术。
该技术能在几小时的实验操作中，
将人为选定的一段
DNA
扩增 几百万倍，
具有灵敏度高、特异性强、操作简便和应用广泛等优点。

PCR
的工作原理类似于
DNA
的体内复制过程，是将待扩增的
DNA
片断和与其< br>两侧互补的寡核苷酸链引物经变性、
退火及延伸三步反应的多次循环，
使特定的
DNA
片断在数量上呈指数增加。
PCR
扩增首先需要一对引物，根据待扩增区域两< br>侧的已知序列合成两个与模板
DNA
互补的寡核苷酸作为引物，
引物序列将决定 扩
增片段的特异性和片段长度。反应体系由模板
DNA
、一对引物、
dNTP
、耐高温的
DNA
聚合酶、酶反应缓冲体系及必须的离子等所组成。
PCR< br>反应循环的第一步为
加热变性，使双链模板
DNA
变性为单链；第二步为复性， 每个引物将与互补的
DNA
序列杂交；
第三步为延伸，
在耐高温的
D NA
聚合酶作用下，
以变性的单链
DNA
为模板，
从引物
3 ˊ端开始按
5ˊ→3ˊ方向合成
DNA
链。
这样经过一个周期的变
性 ——复性——延伸等三步反应就可以产生倍增的
DNA
，
假设
PCR
的效率为
100%,
反复
n
周期后，理论上就能扩增
2
n< br>倍。
PCR
反应一般
30-40
次循环，
DNA
片段 可
放大数百万倍。

常规
PCR
反应用于已知
DNA
序列的扩增，
变性温度为
95
℃
，
复性温度为
37
℃
～
55
℃
，
延伸合成温度为
72
℃
，
DNA
聚合酶为
Taq
酶
（可耐受
95
℃
左右的高温而不失