防止早泄DNA定点突变实验

2021年2月2日发(作者：金枪鱼油软胶囊)
DNA
定点突变实验

标签：

DNA
定点突变

DNA
定点突变可以：
（
1
）研究蛋白 质相互作用位点的结构、改造酶的不同活性或者动力学特性；
（
2
）改造
启动 子或者
DNA
作用元件；
（
3
）提高蛋白的抗原性或者是稳定性、活 性、研究蛋白的晶体结构，以及药
物研发、基因治疗等等方面。

详细

实验方法


Dpn I
法

定点突变是指通过聚 合酶链式反应（
PCR
）等方法向目的
DNA
片段（可以是基因组，也可以是
质粒）中引入所需变化（通常是表征有利方向的变化）
，包括碱基的添加、删除、点突变等。< br>

单点突变的原理是从常规

中经纯化试剂盒
(Minipr ep)
或者氯化铯纯化抽提得到质粒。
设计
一对包含突变位点的引物（正、反向），和模版质粒退火后用
PfuTurbo
聚合酶
“
循环延伸
”< br>，
(
所
谓的循环延伸是指聚合酶按照模版延伸引物，一圈后回到引物
5
’
端终止，再经过反复加热褪火
延伸的循环，这个反应区别于滚环扩增，不会形成多个 串联拷贝。
)
正反向引物的延伸产物退火
后配对成为带缺刻的开环质粒。
Dp nI
酶切延伸产物，
由于原来的模版质粒来源于常规大肠杆菌，
是经
dam< br>甲基化修饰的，对
DpnI
敏感而被切碎（
DpnI
识别序列为甲基化 的
GATC
，
GATC
在
实验方法原理

几乎各种 质粒中都会出现，而且不止一次）
，而体外合成的带突变序列的质粒由于没有甲基化而
不被切开 ，因此在随后的转化中得以成功转化，即可得到突变质粒的克隆。


多点突变的原理 是准备多个带突变的引物
（同方向，
对同一单链模版）
，
退火后全部突变引物
（不
超过
5
个）都结合在同一环状单链模版，
PfuTurbo聚合酶延伸，碰到下一个引物就停止，各片
断经连接成环，和单链模版组成杂和环，
Dpn I
消化双链模版，也消化杂和环中的模版，只留下
新合成的带多个突变的单链环（
mu tant ssDNA
）
，得以转化

，形成双链质粒。资料表明，
引 入
3
个定点突变的效率为
60%
，
5
个定点突变的效率为< br>30%
。得到的其他质粒是带有较少定点
突变的质粒，以引入
3
个定点 突变为例，就是有
40%
左右的转化质粒是带有
1-2
个不同定点突变的质粒（因为存在
1-2
个引物结合模版延伸形成单链环的可能）
。



实验材料

DNA
试剂、试剂盒

pyrobest DNA
聚合酶
DpnI
去离子水
BSA
大肠杆菌
DH5a
菌株

仪器、耗材

PCR
仪离心管移液枪枪头枪头盒水浴锅灭菌锅培养箱

一、引物设计


每条引物都要携带有所需的突变位点，
引物一般长
25~45 bp
，
设计的突变位点需位于引物中部。



二、反应


实验步骤

1.

使用高保真的
pyrobest DNA
聚合酶，循环次数少，一般为
12
个循环。



2.

反应体系：



（
1
）
10x pyrobest Buffer
：

5 ul


（
2
）
dNTP Mixture(10 mM)
：
1 ul
注意事项


（
3
）模板
DNA(5~50 ng)
：
1ul


（
4
）
primer 1 (125 ng)
：
1 ul


（
5
）
primer 2 (125 ng)
：
1 ul


（
6
）
pyrobest DNA polymerase
（
TaKaRa
）
(5 U/ul)
：
0.25 ul


（
7
）加无菌蒸馏水至
50ul.


三、产物沉淀纯化


1.

加
1/10 体积的醋酸钠，
1
倍体积的异丙醇，混匀置冰上
（或
-20
℃冰 箱）
5min
，
离心弃上清。

2.

70~75%
乙醇洗盐两次，烘干后溶于无菌水中（此步可省略，直接用

DpnI
酶切）
。



四、
DpnI
酶切


1.

酶切体系


（
1
）
Buffer
：
2 ul


（
2
）
BSA
（
100
╳）
：
0.2 ul


（
3
）
DNA
：
x ul


（
4
）
DpnI
：
0.5 ul


（
5
）加无菌去离子水至

20 ul
。



2.

30
℃酶切

1~4 h
。


3.

65
℃水浴
15min
终止反应。



五、转化


将酶切产物转化大肠杆菌
DH5a
菌株，利用抗生素筛选突变子。



六、测序验证

展开

1.

引物和 质粒都准备好后，当然就是做
PCR
喽，不过对于
PCR
的酶和
bu ffer
，不能用平时
的，我们做
PCR
把整个质粒扩出来，延伸长度达到几 个
K
，所以要用那些
GC buffer
或扩增长
片段的
b uffer
，另外，要用保真性能较好的
PFU
酶来扩增，防止引进新的突变。





2.

Quick change
试剂盒分为几种不同的类型，
QuikChange®
、
Site- Directed Mutagenesis
Kit
标准点突变试剂盒

、
QuikChange®
、

XL
Site- Directed
Mutagenesis
Kit
长模板单点突
变试剂盒 （
>8kb
）从原理上是一样的，只是
PCR
的酶和
BUFFER< br>不一样，后面用了比较适合
长片段扩增的酶和
BUFFER
罢了，没什么特别的 东西。



3.

DpnI
处理的时间最好长 一点，最少一个小时吧，最好能有两三个小时，因为如果模板处理
得不干净，哪怕只有那么一点点，模板 直接在平板上长出来，就会导致实验失败。



4.

实验板长出来的菌有两种可能，
一种是质粒
DPNI
没处理干净长出来的
（模 板）
，
一种是
PCR
产物转化出来的（突变体）
，不过这两种菌长得 一模一样，即使提出质粒来也是一样（酶切和
PCR
都无法区分）
，除了测序，是分不 出来的。


5.

做
PCR
时也最好做一个负 对照（不加引物）
，实验管由于
PCR
时有引物，所以在
DNPI
处
理前里面既含有模板又含有
PCR
产物，而对照管由于
PCR
时没放 引物，所以在
DPNI
处理前
里面只有模板。如果两者都拿去
DNPI
处理，就能够证明模板已经被去除干净。若实验顺利的
话应该是：正对照长菌负对照不长菌。如果出现 正负对照都长菌，那么就是
DpnI
没处理好，如
果正负对照都不长菌，那么有两种可 能，一种是
PCR
阴性，也就是说
PCR
出问题了，另外一
个可能就 是转化出问题了。要搞清楚是哪个问题，跑胶说明不了问题，那就做个转化的对照，
拿试剂盒的对照实验 去试感受态，马上就能知道转化有没问题。

一、经验分享


1.

实验的目的应该比较明确吧：就是要把自己的基因上面的一个碱基换成另外一个碱基。一般情况下我们会有几种可能使我们需要这样去做：



第一：我们吊出 来的基因有点突变，相信这可能是大家经常会遇到的问题。基因好不容易吊出
来，并装进了自己的载体， 却发现有一两个碱基跟自己的预期序列或所有的公共数据库不匹配，
然后暴昏。



大家实验室里面还是用
Taq
酶为主吧，
Pfu
这样的高 保真酶大家应该用得不多吧，
Taq
酶的优点
和缺点都很明显：优点就是扩增效能强， 缺点就是保真性差，其错配机率是比较高的，相关数
其他

字忘了，大家可以去网上查 那个数字，不过感觉如果是
2000bp
的基因，如果扩四五十个循环的
话，
很大机率会出现点突变，
当然这也跟具体
PCR
体系里的
Buffer
有很大关系，
详细情况这里
就不讨论了。



第二：要 研究基因的功能，在基因上自己选定位置更换碱基的保守序列，或者改造成不同的亚
型，总之就是要人工 改造碱基序列符合自己的实验需要，相信这也是那些研究基因的人经常的
一种思路吧。



对于第一种情况：我们首先要分析出现碱基不匹配的位置是不是重要的位置，如果 不是很重要，
大可不必管它，比如说是三联密码子的最后一位，碱基的改变并没有引起相应氨基酸的改变 ，
那么一般情况下也可以不去理它。另外，在
NCBI
上人类的基因的版本一直在变化 ，也就是说
同一个基因有不同的版本，或者称不同的亚型，其碱基序列有些许的差异，只要自己克隆出来
的碱基序列与其中一个相匹配，一般也就可以不做定点突变了。如果有时间没钱，那干脆重新