科学正确的减肥方法-郝杰
实验一
DNA
的小量制备
小量法提取植物基因组
DNA
(
CTAB
法)
1
实验目的:
随着基因工程等分子生物学技术的迅速发展及广泛应用,人们经常需要提 取高
分子量的植物
DNA
,用于构建基因文库、基因组
southern
分析、酶切及克隆等,
这是研究基因结构和功能的重要步骤。本实 验目的是学习从植物材料中提取和测定
DNA
的原理并掌握
CTAB
提取
DNA
的方法,进一步了解
DNA
的性质。
2
实验原理
细胞中的
DNA
绝大多数以< br>DNA-
蛋白复合物(
DNP
)的形式存在于细胞核内。
提取
DNA
时,一般先破碎细胞释放出
DNP
,再用含少量异戊醇的氯仿除去蛋白质,< br>最后用乙醇把
DNA
从抽提液中沉淀出来。
DNP
与核糖核蛋白(
RNP
)在不同浓度
的电解质溶液中溶解度差别很大,利用这一特性可将二者分离。以
NaCl
溶液为例:
RNP
在
0.14mol/L NaCl
中溶解度很大,而
DNP
在其中的溶解度仅为纯水中的
1
%。
当
NaCl
浓度逐渐增大时,
RNP
的溶解度变化不大,
而
DNP
的溶解则随之不断增加。
当
NaCl
浓度大于
1mol/L
时,
DNP
的溶解度最大,为纯水中溶解度的
2
倍,因此通
常可用
1.4mol/L NaCl
提取
DNA
。
为了得到纯的
DNA
制品,
可用适量的
RNase
处理
提取液,以降解
DNA
中搀杂的
RNA
。
关于植物总
DNA
的提取主要有两种方法:
1
.
CTAB
法:
CTAB
(十六烷基三甲基溴化铵,
hexadecyltr imethylammonium
bromide,
简称
CTAB
):是一种阳离子去污剂,可溶解细胞膜,它能与核酸形成复合物,在高盐溶
液中
(
0.7mol/LNaCl
)
是可溶的,
当降低溶液盐的浓度到一定程度
(< br>0.3 mol/L NaCl
)
时从溶液中沉淀,
通过离心就可将
CTAB
与核酸的复合物同蛋白、
多糖类物质分开,
然后将
CTAB
与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液中,再加入乙醇使核酸沉淀,
CTAB
能溶解于乙醇中。
2
.
SDS
法:
利用高浓度的阴离子去垢剂
SDS
(十二烷基磺酸钠,
Sodium dodecyl sulfate,
简
称
SDS
)使
DNA 与蛋白质分离,在高温(
55
~
65
℃)条件下裂解细胞,使染色体离< br>析,蛋白变性,释放出核酸,然后采用提高盐浓度及降低温度的方法使蛋白质及多
糖杂质沉淀,< br>离心后除去沉淀,
上清液中的
DNA
用酚
/
氯仿抽提,
反复抽提后用乙醇
沉淀水相中的
DNA
。一般生物体的基因组
DNA 为
107~109bp
,在基因克隆工作中,
通常要求制备的大分子
DN A
的分子量为克隆片段长度的
4
倍以上,否则会由于制
备过程中随机断裂 的末端多为平末端,导致酶切后有效末端太少,可用于克隆的比
例太低,严重影响克隆工作。因此有效制 备大分子
DNA
的方法必须考虑两个原则:
(
1
)尽量去除蛋白质 、
RNA
、次生代谢物质(如多酚、类黄酮等)
、多糖等杂质,
并防止和抑制 内源
DNase
对
DNA
的降解。
(
2
)
尽量减少对溶液中
DNA
的机械剪切
破坏。
几乎所有的
DNase
都需要
Mg2+
或
Mn2+
为辅因子,故实现(
1
)尽量去除蛋白
质的要求,需加入一定浓度的螯合剂,如
EDTA
、柠檬酸,而且整个提取过程应在
较低温度下进行(一般利用液氮或冰浴)
。为实现(
2
)需要在
DNA
处于溶解状态
时,尽量减弱溶液的涡旋,而且动作要轻柔,在进行
DNA
溶液转移时用大口(或
剪口)吸管。提取的
DNA
是否为纯净、双链、高分 子的化合物,一般要通过紫外
吸收、化学测定、
“
熔点
”
(
melting temperature, Tm
)测定、电镜观察及电泳分离等
方法鉴定。本实验采用
CTAB
法提取
DNA
并通过紫外吸收法鉴定。
3
材料和试剂:
3.1
长春花叶片
3.2
试剂
(
1
)
CTAB
提取缓冲液:
100 mmol/L Tris-HCl
(
pH8.0
)
,
20 mmol/L EDTA-Na2
,
1.4mol/LNaCl
(如表
1
)
,
2% CTAB
,使用前加入
0.1%
(
V/V
)的
β
-
巯基乙醇。
表
1 CTAB
提取缓冲液配制
用
HCl
调
pH
值。
(
2
)
TE
缓冲液:
10mmol/L Tris- HCl, 1mM EDTA
(
pH8.0
)
。
(
3
)
氯仿
/
异戊醇:
将氯仿和异戊醇按体积
2 4:1
的比例混匀,
置棕色瓶中,
4
℃保存。
4
仪器设备
离心机、
3
离心管、紫外分光光度计、微量移液器、吸头 、吸水纸、水浴锅、冰
箱、电子天平、高压灭菌锅、一次性手套、电泳仪等。
5
方法与步骤:
5.1
在提取过程中用到的吸头,提取缓冲液等先高压灭菌 (
121
℃,
20min
)
,取
出后待用;
5.2
取大约指甲盖大小的植物叶片,放入1.5ml
的
EP
管中
,
加入液氮,用钢珠研
磨成粉 末状,再加入
6
00μ
L
的
CTAB
提取缓冲液,
;
5.3 65
℃水浴锅中水浴< br>40min
,加入等体积的氯仿:异戊醇
(24:1)
,
轻轻混匀,颠
倒几次,乳化
1min
。
4
℃,
11,000rpm
离心
10min
;
5.4
吸上清到新离心管中(约
4 00
μ
l
)
,加入等体积预冷异丙醇,混匀,
-20
℃放< br>置
20min
沉淀
DNA
;
5.5 5000 rpm
常温离心
15min
,倒掉上清液;
5.6
用
75%
乙醇(
900
μ
l< br>)洗沉淀,
11,000rpm
离心
2min
,倒掉乙醇,再用乙醇< br>同样处理一次;
5.7
置于干燥仪干燥
10min
,将水分蒸干;
5.8
加入
50μ
L
去离子水,融解
DNA
,同时加入
RNA
酶
(
按每
50μ
L DNA
加入
1μ
L
RNase)
,
37
℃
30min
;
5.9
利用分光光度计检测
OD260,
同时进行
1
%凝 胶电泳检测;
5.10
琼脂糖电泳检测
DNA
:制作
1 %
的琼脂糖凝胶,吸取提取的
DNA
溶液
5μ
L
电泳检测;
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