-小麦麸
苏教版高中生物选修
1-4.1.2
凝胶色谱法分离血红蛋白
-
学案设计（无答案）
凝胶色谱法分离血红蛋白
【学习目标】
1
．尝试从血液中提取和分离血红蛋白
2
．了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理
【学习重难点】
教学重点：凝胶色谱法的原理和方法
教学难点：样品的预处理；色谱柱填料的处理和色谱柱的装填
【学习过程】
DNA
的粗提取和鉴定
完成下列实验步骤：
一、凝胶色谱法
1
．概念：也称做
；是根据
分离蛋白质的有效方法。
2
．原理
（
1
）由
构成的凝胶，内部有许多贯穿的的
。
（
2
）当
不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量
的蛋白质容
1
/
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凝胶色谱法分离血红蛋白
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学案设计（无答案）
易进入凝胶内部的通道，路程
，移动速度
，而相对分子质量
的蛋白质
无法进入凝胶内部的通道，只能在
移动，路程
，移动速度
，从而使
不同的蛋白质分子得以分离。
二、缓冲溶液
1
．作用：在一定范围内，抵制
的
对溶液
pH
的影响，维持
pH
。
2
．配制：
由
种缓冲剂溶解于
中配制而成，
通过调节缓冲剂的
就
可以得到不同
pH
范围内使用的缓冲液。
三、电泳
1
．概念：指
在电厂的作用下发生
的过程。
2
．原理：在一定的
下，
、
等生物大分子的可解离基团会带上
或
，
在
的作用下，
这些带电分子会向着与其所带电荷
的
电极移动。
3
．作用：电泳利用了待分离样品中各种分子
的差异及分子本身的
、
的不同，使带电分子产生不同的
，从而实现样品中
的分离。
4
．方法：
常用的电泳方法有
和
。
测定蛋白质分子量时通常使用
。
四、实验操作
1
．样品处理：通过
、
、
等操作收集血红蛋白溶液。
（
1
）
红细胞的洗涤：
目的是
。
分离时采取
，
直至上清液中没有
，
表明红细胞已洗涤干净。过程：血液＋柠檬酸钠→低速短时离心→吸出上层血浆→红细胞＋< br>5
倍体积生理盐水
→缓慢搅拌
10min
→低速短时离心→ 吸出上清液→反复洗涤直至上清液无黄
色
（
2
）血红蛋白的释放：在
和
的作用下，红细胞破裂，释放出血红蛋白。
（
3
）分离血红蛋白溶液：把
离心后，将试管中的液体用
过滤、除
去
，于
中静置片刻后，分离出下层的
。
2
．粗分离：即透析
（
1
）
方法：
将血红蛋白溶液装入
，
将
放入一定量适宜浓度的
中，
透析
。
（
2
）目的：将
的杂质除去。
（
3
）原理：透析袋能使小分子自由进出，而将大分子物质保留在袋内。
3
．纯化：通过凝胶色谱柱将相对分子质量较大的杂质蛋白除去。操作如下：
（
1
）凝胶色谱柱的制作。
2
/
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说出制作色谱柱需要的材料。
色谱柱的制作过程：准备材料→加工橡皮塞→安装色谱柱
（
2
）凝胶色谱柱的装填
①材料：本实验使用的是
。
②方法：凝胶用
充分溶胀后。配成
，一次性
倒人色谱柱内。
不能有
存在；不能发生
流干露出凝胶颗粒的现象。
色谱柱的装填过程。
步骤
①
②
胶
③
④
操作要求
计算称量凝
操作要求
色谱柱垂直固定在支架上
根据色谱柱体积计算凝胶用量
凝胶颗粒＋蒸馏水→充分溶胀
凝胶颗粒＋洗脱液→沸水浴
一次性缓慢倒入；轻轻敲打
立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡
12h
配制悬浮液
装填悬浮液
缓冲液洗涤
⑤
平衡
（
3
）样品的加入和洗脱
①
A
．准备：加样前，打开流出口，使柱内凝胶面上的
缓慢下降到与
平齐，
关闭出口。
B
．加样：用
小心地将
1mL
透析后的样品加到
的顶端，注意不要破
坏
。
C
．加样后：打开下端出口，使样品渗入
内。
②洗脱：加入
，打开下端出口，进行
。
基本过程是：
调节缓冲液面→加入蛋白质样品→调节缓冲液面→洗脱→收集分装蛋白质
4
．纯度鉴定：在鉴定的方法中，使用最多的是
。
五、操作提示
1
．红细胞的洗涤：
、
与
十分重要。
过少，无法除去
血浆蛋白；
过高和
过长会使
等一同沉淀，达不到分离效果。
2
．色谱柱填料的处理：商品凝胶使用前需直接放在
中膨胀，可以将加入其中的
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本文更新与2021-02-02 03:47，由作者提供，不代表本网站立场，转载请注明出处：http://www.xapfxb.com/yuer/441370.html