嚼槟榔头晕-乳腺增生的治疗方法
致
谢
本手册的出版由
UNDP/UNFPA /WHO/
世界银行人类生殖研究、发展和研究
培训特别规划署及
WHO
人类 生殖健康与研究部共同完成。
我们对所有参与本手
册筹备、编辑和校订的人员表示诚挚的感谢。
另外感谢：
Ms
Cathy
Treece,
Ms
Charlene
Tollner
和
Jim
Overstreet
教授
(University of California, Davis, CA, USA)
提供形态学显微照片以及对媒体文件的
校对；
Dr Rune Eliasson (Sophiahemmet Hospital, Stockholm, Sweden)
帮助定义非
精子细胞；
Dr Gary N Clarke (The Royal Women
?
s Hospital, Carlton, Australia), Dr
Roelof
Menkveld
(Tygerberg
Academic
Hospital
and
University
of
Stellenbosch,
Tygerberg, South Africa)
和
Pieter Wranz
教授
(University of Stellenbosch, Tygerberg,
South Africa)
对本手册编译工作提供附注。
衷心感谢国际男科学会提供的经济支持。
这个版本的手册是为纪念已故前
W HO
男性生育调控方法学工作组负责人
Geoffrey Waites (1928-200 5)
，
他也是第二、
第三和第四版实验室手册的共同编辑。
编辑委员会全身心 投入工作的动力来自于对
Geoff
诚实、
公平和关心疾苦人格的
欣赏。
1
缩写词
Ab
antibody
抗体
AI
artificial insemination
人工授精
AID
artificial insemination with donor semen
供精人工授精
AIH
artificial insemination with husband
’
s semen
夫精人工授精
ALH
amplitude of lateral head displacement
头侧摆振幅
ANOV
A
analysis of variance
变量分析
APAAP
alkaline
phosphatase:
anti-alkaline
phosphatase
complex
碱性磷酸酶
:
抗
碱性磷酸酶复合物
AR
acrosome-reacted
顶体反应
ART
assisted reproductive technology
辅助生殖技术
ASA
anti-sperm antibody
抗精子抗体
BCF
beat-cross frequency (Hz)
交打频率
BSA
bovine serum albumin
牛血清白蛋白
BWW
Biggers, Whitten and Whittingham
试液
CASA
computer- aided sperm analysis
计算机辅助精子分析
CASMA
computer aided sperm morphometric assessment
计算机辅助精子形态评
估
CBA
VD
congenital bilateral absence of the vas deferens
先天性双侧输精管缺失
CD
compact disk
压缩盘
CD
cytoplasmic droplet
胞质小滴
CD45
cluster of determination 45 (pan-leukocyte marker)
决定簇
45 (
全白细胞标
记物
)
CD46
cluster of determination 46 (acrosomal antigen)
决定簇
46 (
顶体抗原
)
CI
confidence interval
可信区间
CL
confidence limits
可信界限
CO
2
carbon dioxide
二氧化碳
DMSO
dimethyl sulfoxide
二甲基亚砜
DNA
deoxyribonucleic acid
脱氧核糖核酸
DPBS
Dulbecco’s phosphate
-buffered saline
Dulbecco’s
磷酸缓冲盐溶液
DVD
digital versatile disc
数字多用盘
EDTA
ethylenediamine tetra-acetic acid
乙二胺四乙酸（依地酸）
EQA
external quality assurance
外质量保险
EQC
external quality control
外质量控制
ERC
excess residual cytoplasm
残余胞质
FITC
fuorescein isothiocyanate
FMLP
formyl-methionyl-leucyl-phe nylalanine
甲酰
-
甲硫氨酰
-
亮氨酰
-
苯丙氨酸
GIFT
gamete intrafallopian transfer
输卵管内配子移植术
GPC
glycerophosphocholine
H
2
O
2
hydrogen peroxide
过氧化氢
HBSS
Hanks’ balanced salt solution
Hanks
’
平衡盐溶液
HBV
hepatitis B virus
乙肝病毒
hCG
human chorionic gonadotrophin
人绒毛膜促性腺激素
2
HCV
hepatitis C virus
丙肝病毒
HIV
human immunodefciency virus
人免疫缺陷病毒
HOP
hamster oocyte penetration
仓鼠卵穿透
HOS
hypo-osmotic swelling
低渗肿胀试验
HPF
high power field
高倍视野
HRP
horseradish peroxidase
辣根过氧化物酶
HSA
human serum albuminxiv
人血清白蛋白
IV
HTF
human tubal fuid
人输卵管液
IB
immunobead
免疫珠
IBT
immunobead test
免疫珠试验
ICSI
intracytoplasmic sperm injection
胞浆内精子注射
Ig
immunoglobulin
免疫球蛋白
IM
immotility
不动
IQC
internal quality control
内质量控制
IU
international unit
国际单位
IUI
intrauterine insemination
宫腔内人工授精
IVF
in vitro fertilization
体外受精
KRM
Krebs-Ringer Medium
Krebs-Ringer
培养液
LIN
linearity
线性
LLQ
lower limit of quantifcation
定量下限
LPF
low power field
低倍视野
MAD
mean angular displacement
平均角位移
MAI
multiple anomalies index
复合异常指数
MAR
mixed antiglobulin reaction
混合抗球蛋白反应
NA
numerical aperture
数值孔径
NP
non-progressive (motility)
非前向的（活力）
PBS
phosphate-buffered saline
磷酸缓冲盐溶液
PDCA
plan, do, check, act
PMA
phorbol 12-myristate 13-acetate
(12-)
十四酸佛波酯
(-13-)
乙酸盐
PMSG
pregnant mare serum gonadotrophin
孕马血清
PNPG
p-nitrophenol glucopyranoside
对硝基苯酚吡喃葡萄糖苷
PR
progressive (motility)
前向的（活力）
PSA
Pisum sativum agglutinin
碗豆凝集素
QA
quality assurance
质量保险
QC
quality control
质量控制
RCF
relative centrifugal force
相对离心力
RI
refractive index
屈光指数
RNA
ribonucleic acid
核糖核酸
ROS
reactive oxygen species
活性氧类物质
rpm
revolutions per minute
每分钟转速
SD
standard deviation
标准差
SDI
sperm deformity index
精子畸形指数
SDS
sodium dodecyl sulfate
十二烷基硫酸钠
SE
standard error
标准误
3
SOP
standard operating procedure
标准操作流程
STR
straightness (VSL/V
AP)
直向
TBS
Tris- buffered saline
Tris
缓冲盐溶液
TGG
Tyrode’s glucose glycerol
TZI
teratozoospermia index
畸形精子症指数
V
AP
average path velocity
平均轨道速率
VCL
curvilinear velocity
曲线速率
VSL
straight- line (rectilinear) velocity
直线速率
WHO
World Health Organization
世界卫生组织
WOB
wobble (V
AP/VCL)
摆动
4
第
1
章
背景
1.1
导言
鉴于人类精液 检查标准化需求的日益增加，世界卫生组织于
1980
年首次出
版了
《世界卫 生组织人类精液及精子
-
宫颈粘液相互作用实验室检验手册》
。
至今，
该手册已改版三次，被译成多国语言。过去
30
年中，该手册作为全球范围内的
标准 被世界各地的临床及科研工作者广泛使用。
尽管前几版的发行很成功，
但是随着新证 据的出现，
先前版本中的一些推荐
指标需要被修正就变得更明显了。
同时，
对 一些概念也需给出更多的解释和支持
证据。出于上述考虑，
WHO
成立了编辑委员会， 回顾手册中描述的各种方法，
本版旨在修改、
更新这些内容。
由于按照先前版本中讲述 的方法获取的数据不充
分，
某些情况下修正工作变得异常困难。
有时，
某些实 验室可以获得的一致结果，
在其他实验室却无法得以验证。
鉴于这些情况，
编辑委员会 在对以往文献资料评
估后，达成一致，统一标准。
由于需要对先前版本中讲述的方法 进行更详细的描述，
技术员和科学工作者
们给出了补充推荐内容。
因为前几版手册缺乏 对细节的描述，
一些实验室采用其
它方法或是发展出自己的操作规程，
然而他们却仍申 称是按照
WHO
手册进行精
液分析的。
为了使全球范围内的比较更容易实现，
第五版手册包含了更多的细节
描述。
当提出不同的分析方法时，
手册中对原由 做了解释。
参照该手册在发表论
文中报道实验结果时，我们推荐各个实验室要指明所采用的是哪 一种方法。
1.2
第
5
版
第
5
版包含三部分内容：精液分析（第
2- 4
章）
，精子制备（第
5
、
6
章）
及质量评估（第
7
章）
。第Ⅰ部分介绍精液分析，参照先前版本，但被分为三个
小章节：标准化方法
（介绍决定精液质量的常规操作流程）
；
可供选择的试验
（这
些试验用于某些特定情况下或由实验人员选择）
；研究试验（这些试验目前不作
为精液 常规分析的方法）
。由于通常在男科学实验室不能开展精液培养，因此这
些内容仅在无菌化精液 标本采集部分提及。
精子制备章节的内容从射出精液扩展
到对睾丸和附睾获得精子的制备。本手 册中散在分布的方法学注释框有注解
(
方
法学解释
)
、评论（结果解 释）以及说明框
(
包括补充解释的物质
)
。
5
第
5
版手册的主要特点如下所列：
?
精液分析 章节包括涉及工作溶液的配制、操作流程、精子计数及对结果解释
的详细描述，以使所有给出的方法学都 非常完整，与手册中其它章节内容的
重叠极少。
?
扩展了精子制 备部分的内容，增加了关于精子冷冻保存的新章节。与宫颈粘
液分析相关的操作规程被分到可供选择的试 验章节及附录中粘液特征的检查
部分。
?
与先前的版本相比，第 五版的附录内容减少。这部分内容仅限于特殊的或者
很少被用到的信息。
?
精子数目的评估。对于一份精液标本的检查，精液的稀释度和评估精子数目
所需观察的计数池区 域的大小均有所改变，每次需计数
200
条精子。新版手
册中强调了抽样误差的重要性 及计数结果的确定性。编辑委员会认为每次排
精的总数目比精子密度能更准确的评估睾丸功能，但这要求 对精液量的测定
需准确无误。
?
无精子症的评估。这尽管表面看 起来简单，但很多因素会影响无精子症的诊
断，包括计数太少数目精子导致的明显误差，观察显微镜视野 的数目，以及
检验布满碎片精子沉淀物的困难度。本手册推荐改为检验固定后、未离心的
标本， 以及指出所用计数方法的灵敏度。然而，当需收集足够数目的精子用
于治疗时，离心方法仍是必需的。另 外，手册中也介绍了通过检验未固定标
本中的活动精子以评估输精管切除术疗效的方法。
?
精子活力的评估。第五版与先前版本的主要不同在于对精子活力的分级。目
前推荐精子活力被分为前向运动、
非前向运动的不动精子
（而不再分为
a, b, c
和
d
级）
。
?
精子形态的评估。一 些实验室仅仅评估正常精子的比例，然而有些人认为形
态异常的类型、部位及程度更加重要。
?
质控。此章第五版为重新编写。精液分析过程的健全对于精液分析严格质控
至关重要。
当质控结果不满意时，
文中的提示和建议有助于增进实验室水平。
?
参考范围和参考低值。
本手册参考范围值来自
12
个月 以内配偶获妊娠的男性
的精液数据。
原始数据为来自
3
大洲的
8个国家的可生育男性的
400-1900
份
6
精液样本。传 统统计学方法为取双向参考区间的第
2.5
百分位作为阈值，低
于此阈值则可认为来自 不同的人群。
但是，
单向参考区间更适用于精液分析，
因为任意参数的高值并不能对生 育作出决定性的判断。第
5
百分位可作为最
低参考值，每一参数的完全分布区间见附录
1
。
1.3
本手册的范围
本手册所载的方法可作为指南以增进精液的综合分析和可比性。但并非为
地方、
国家或全球性的实验室认证机构所必备。
精液分析在临床和研究机构对男
性生育 功能的调节和追踪中，
其对男性生育状态和精子发生的监控都是极为必要
的。
（上海交通大学医学院附属第九人民医院生殖中心
曹少峰博士）
7
第
2
章
标准程序
2.1
简介
正常精液是一种混合物，
在射精时由睾丸和附睾的分泌液及悬浮其中的 精子
与前列腺、
精囊腺和尿道球腺的分泌物混合而成。
最终射出的混合物是一种粘稠< br>的液体，
即射出的精液以团块状连续数次射出，
通过输精管切除术前后的比较显
示，就体积而言有
90%
是自附属腺体的分泌物，其中主要是前列腺和精囊腺，少
部分 来自尿道球腺和附睾。
精液的两个主要量化指标：
1
．精子总数，反应睾丸的生精状况和睾丸后管道系统的通畅程度。
2
．体积反应腺体的分泌能力。
精子功能组要受精子自身的活力、运动、形态和精浆成份的影响。
在性交排精时，< br>最初富含精子和前列腺液部分的精液可能和延续在阴道中宫
颈粘液丝相互接触，
而其余部 分在形成而在实验留取标本时，
全部精液留取在一
个容器中，
精子限在由精囊腺分泌蛋 白导致的凝块中，
随后在前列腺分泌的酶作
用下而水解。
有证据表明精液样 本质量的变化与取样方式和地点有关，
通常在家里用性交
法留取的质量较高，说明不同排精方式 明显影响样本的检验结果。
在固定条件下精液样本质量主要受睾丸生精功能、
附属腺 体的分泌、
近期患
病情况尤其高热性疾病，
及其以它如禁欲时间的长短，
这些 在解释监测结果时都
应考虑进去。
精液质量分析结果主要受以下因素的影响：
1
．样本收集是否完整。射精时 前面富含精子部分的精液避免丢失，后面部
分精液主要是由精囊腺的分泌物构成，
所以，
前面部分精液的丢失比后半部分丢
失对精液分析结果影响更大。
2
．在射 精时，附属腺体分泌物冲淡含高度浓度精子的附睾液。精子浓度不
能直接反应睾丸的精子产量，
因为还受其他生殖器官功能的影响，
而精子总数
（精
子密度
X
精液体 积）精子密度对于年轻人和老年人没有区别，但精子总数可能存
在差异，至少人群中有部分人存在随着年 龄增大而精液体积和精子下降的现象。
3
．
精子的活力和染色体不受禁欲时 间长短的影响，
除非附睾功能受到影响。
8
由于前次射精不彻底，
附睾没完全排空，
有部分精子残存，
精子老化会影响精子
质量，其程度很难确定，所 以也很少做考虑。
4
．睾丸体积的大小不仅能反应睾丸的生精水平还影响到每次射精 的精子总
数和精子形态。
注释：
精液质量的巨大生理 变化是上述所列多种因素的反映
(Castilla
等
.,
2006)
，因而同精液相关的所有分析都要精确全面。
这些多变的非可控因素解释了众所周知的个体精液成分的变化
(Baker &
Kovacs, 1985; Alvarez
等
,2003).
图
2.1
显示了参与一个雄性激素避孕药研究的
安慰剂组的
5名年轻志愿者，
根据
WHO
推荐的方法的精液评估结果，
其精液成分是伴随时间发生变化的。这一变化表明要对精液分析进行如下说明：
1
．仅凭一次精液检查不能确定精子质量。
2
．检查两到三次有助于获得可靠的基本数据
(Poland
等
, 1985; Berman
等
,
1996; Carlsen
等
, 2004; Castilla
等
, 2006; Keel,2006)
。
虽然对整个精液样本进行了分析，
但其结果并不能 确定那些少数到达受精部
位精子的受精能力，精液分析能为临床提供有关患者个人状况的一些重要信息。
样本的采集和检查都按照规范化程序进行，
其结果才有价值。
本章所述操作
流程被认定为进行精液评估的基本组成步骤。
9
图
2.1
在超过
18
个月的时间内精子总数目和精液浓度的变化
（以上数据提供由先灵葆雅和拜耳药业提供）
精液分析包括以下几个步骤（在以后章节中详述）：
【在最初五分钟】
将受精精液样本容器放置在温控台或水浴箱里（
37
℃）等待液化。
在
30
到
60
分钟期间
评估精液的液化情况和物理性状。
测量精液体积。
如有需要则检测精液的
pH
值。
准备湿片观察显微镜下精子的活动情况，计数时还需进行稀释。
如活动精子较少，需评估精子活动率。
制作精液涂片评估精子形态。
对精液进行稀释后做精子密度评估。
对精子进行计数。
如有需要可进行抗免疫珠混合反应检测。
如发现圆形细胞则可检测过氧化酶阳性细胞。
10
如有需要可对精子做免疫珠试验的准备。
如需检测精浆生化指标则对精液进行离心。
【在三小时内】
将精液样本送至微生物检验室（如有需要）。
【四小时后】
对精液涂片进行固定、染色以备精子形态学检查。
【在当日稍后（如冷冻样本则可在次日）】
检查附属腺体功能的指标。
进行间接免疫珠试验检测（如有需要）。
2.2
样本采集
2.2.1
准备
为了减少外界温度和样本收集到检测期间过长对精液检测 结果的影响，
样本
采集应在靠近实验室比较私密的房间里进行。缩短样本从采集到检测的间隔时
间，
标本采集时间应为禁欲至少两天，
最长不超过七天。
如需复查每次禁欲的 天
数应尽可能恒定。
给患者一个明确的书面或口头有关采样指导说明，
应该 强调样本收集必须完
整，如有样本丢失及时告诉医生。
在报告中应包括如下信息：患 者姓名、出生日期、禁欲时间、采样日期、样
本是否完整、采样是否困难及从采样到检测的间隔时间。< br>
2.2.2
为了诊断和研究目的样本采集
应用手淫的方法取精液 ，
并射入一干净的、
广口的玻璃或塑料容器中。
应通
过实验证实容器对精子没 有毒性作用
(
见框
2.1)
。
盛有精液的容器 应放置在
20
～
37
℃环境中，
以免温差变化影响精子活力，
容
器必须标明受检者姓名（和
/
或身份证号码）以及标本采集的日期和时间。
将盛有精液样本的容器置于恒温台或水浴箱中，
等待其液化。
报告中应注明
样本采集是否完整，
尤其富含精子的射精最初部分。
如有丢失应在禁欲
2
～
7
天后
再次采集作进一步检测。
11
评述
2.1
精液收集管兼容性的判定
选取若干精子浓度高且精子 活力佳的精液样本。
每份标本的一半置入已知无
毒的容器（对照）内，另一半置入待测容器。室 温
37
℃下，在
4
小时内每隔
1
小时
重复评估精子 活力（见
2.5
章）。如果每一时间点对照容器和待测容器间无差异
（配对
t
检验
P>0.05
），则待测容器可以被认定为无精子毒性，因而符合精液收
集器具的标准。
2.2.3
用于辅助受孕的精液样本的消毒
对 于用来临床诊断，
但收集样本容器、
吸头及用来混匀的吸管同样要进行消
毒
。
2.2.4
对要进行微生物检测精液样本的采集
这时，必须要 避免来自精液以外的污染（外周皮肤）收集样本容器、吸头及
用来混匀的吸管同样要进行消毒。
患者需按下列步骤进行：
排尿；
用肥皂清洗手和阴茎；
冲去残留肥皂；
用一次性毛巾擦手和阴茎；
射入干净的容器中。
注：
精液样本的收集和实验室显微生物操作开始的时间 间隔不可超过
3
小时。
2.2.5
家中样本采集
对于除了在自家以外的环境下取精的确困难者，可以在家中进行样本采集。
给患者以 明确的书面或口头形式的有关精液样本的采集和转运指导说明，
应
强调采集样本必须完整，如有 部分丢失应在报告中加以说明。
对已标上姓名和身份证号的容器进行称重，然后交给患者。
患者应记录采集的时间，并在一小时内送至实验室。
在送至实验室途中样本应保持在
20
～
37
℃的环境中。
报告中应注明样本采集的地点是在家还是在其他实验室以外的地方。
12
2.2.6
用避孕套采集样本
对通过手淫法采集精液困难的情况下，才采用避孕套通过性交法获取精液。
只能用经特殊设计对精子没有毒性的避孕套来采样，这种避孕套现已有售。
应告知患者使用避孕套方法以及如何将样本转运至实验室。
应记录样本采集的时间，并在一小时内送至实验室。
在送至实验室途中样本应保持在
20
～
37
℃的环境中。
报告应注明样本的采集是在利用避孕套通过性交法及采集地点。
注：一定不可使用普通避孕套收集精液，
因为它们一般含有干扰精子活力的成分
(Jones
等
, 1986).
注释
1:
体外射精不是精液收集的可靠手段，
因为含有大量精子的精液初始部分
可能遗失。
而 且，
这可能造成样本的细菌性或真菌性污染，
且阴道内的酸性环境
会对精子活力造成不 利影响。
注释
2
：
如果患者无法提供精液样本，性交后 试验（见
3.3.1
节）可能会提供其精
子情况的相关信息。
2.2.7
样本的安全处理
精液样本可能含有害的病原体（如乙肝病毒、
HIV
），应作为生物污染物处
理，如是为了宫腔内人工授精、体外受精、单精子胞浆 内注射、培养，注意消毒
应严格按照附录
2
中安全处理指南进行，实验室试验应以安全 为基础。
2.3
初步肉眼观察
精液液化后经简单观 察应立即进行检查分析，
最好在
30
分钟内完成，
不要超
过一个小时 。以免水分丢失或温度的变化而影响精液质量
。
2.3.1
液化
精液射入容器后立即形成典型的半透明凝块，
室温下在数分钟内，
精液通常
开 始液化（变稀），此时可以看到不均匀的凝块在液体中。随着继续液化，精液
将变成均匀的水样物，最后只看到很小的凝块，
室温下一般在
15
分钟内通常都能
完全液化，很 少超过
60
分钟。如在
60
分钟内没完全液化，应记录这种情况，在家
或利用避孕套采集的样本通常在送达实验室时都已液化。
正常精液可以含有不液
化的胶冻状颗 粒，
这一现象似乎没有任何临床意义。
粘液丝的出现可能干扰精液
13
分析。
注
1
：
液化可以通过宏观（如上所述）和微观两方 面来断定。固化精子可通过精
液液化而获得运动能力。
如果在显微检测中观察到固化精子，则需更多时间以保
证液化过程的完成。
注
2
：
在液化 过程中，持续轻柔的混匀或旋转样本容器可以降低精液密度测定过
程中的误差。
注< br>3
：
如果精液在
30
分钟内未液化，
不要进行任何精液分析，
而应再等待
30
分钟。
如果在
60
分钟内精液仍未液化，则 参照
2.3.1.1
节进行处理。
2.3.1.1
液化延迟
偶有精液不液化，需另行处理，机械混匀或用酶消化可能是必要的。
1
．加入等量的培养液
(
如杜氏磷酸盐缓冲液
,
详见附录
4
，
A4.2
节
)
，然后重
复用加样器吹打也可以 使某些样本液化。
2
．用带有规格为
18
或
19
号注射针头的注射器对精液进行反复抽吸
6
～
10
次。
3
．
用菠萝蛋白酶或糜蛋白酶
(EC 3.4.22.32)
的消化 作用可以促进精液液化
（见
框
2.2
）
。制备方法为
10I U/l
的菠萝蛋白酶置入杜氏磷酸盐缓冲液（见附录
A4.2
）
4
．对液化确困难的精液，可以将样本与酶按比例
(1:2)
进行混匀置于
37
℃水
浴箱内
10
分钟，即可液化，再做进一步检测。
注释 ：
这些处理可能会影响到精浆的生化性质，
精子活力以及精子外形，
如有使
用 必须记录。
用菠萝蛋白酶以
1+1
（
1:2
）
的方式稀释精 液必须在评估了精子浓度
后以其结果作为说明。
2.3.2
精液粘稠度
液化后，
用口径约
1.5 mm
的塑料吸管缓 慢地将精液吸入，
观察在重心作用下
精液形成粘液丝的长度，正常时为液滴不间断落下，异常时 粘液丝长超过
2 cm
，
也可以观察用玻璃棒插入精液提起后形成粘液丝的长度，
超过
2 cm
即为异常，
这
都应作记录。
部分不液化样本，
表现为精液粘稠度不随 时间延长而改变，
对于那
些高度黏稠的样本减轻粘稠的方法同处理精液液化延长相同
(
见
2.3.1.1
节
)
。
注释：
高粘稠 度会干扰对就精子活力、
密度的判定以及对覆盖在精子表面的抗体
和生化标志物的检测。
14
2.3.3
精液外观
正常精液液化后应呈均质、灰白色的外观。
如果精子密度非常低，
精液可显 得透明一些。
如有红细胞，
精液可呈红褐色；
病人如有黄疸或服用某些维生素，精液可 呈黄色。
2.3.4
精液体积
精液主要是由精囊腺和前列腺的 分泌物和占小部分的尿道球腺和附睾分泌
物构成，
体积的精确测量对评估精液非常重要，
他影响精液中精子总数和非精子
细胞数的计算。最佳办法是采集样本容器的称重。
用事先称重的一次性清洁容器收集样本；
给装有样本的容器称重；
减去容器的重量；
根据样本重量计算体积，
假定精液密度为
1 g/ml
精液密度在
1.043
和
1.102
g/ml
之间
(Huggins
等
, 1942;
Brazil
等
, 2004a; Cooper
等
, 2007))
。
注：
空样本容器可能具有不同的重量，
所以每一容 器必须提前分别称重。
用不退
色标记笔在容器上标明或粘贴标签标识其重量。
如粘贴标 签标识其重量，
应在称
重前即粘贴标签。
此外，可以直接测量精液体积。
将精液直接射入广口带有刻度的锥形底量筒中，器材均可从市场上购得。
从量筒上直接读取数值（精确到
0.1 ml
）。
注：
不 推荐用移液器或是注射器从标本容器中吸取样本然后注入量筒中测量体
积，
因该方式无法保证不 损失样本，
而这会导致对体积的低估。
该法导致的体积
损失量在
0.3
到
0.9ml
之间（
Brazil
等，
2004a
；
Iwamoto
等，
2006
；
Cooper
等
,
2007
）。
注释
1
：
低精液体积是生殖道梗阻 或先天性双侧输精管缺如
（
CBAVD
）
(de la Taille
等
, 1998; Weiske
等
, 2000; Daudin
等
, 2000; von Eckardstein
等
, 2000)
的特征。
同
时也可能是精囊发育不良的一个表现。
< br>注释
2
：
低精液体积也可能是在精液收集过程中产生了问题
（如损失了 部分精液）
，
也可能为部分
逆行射精或有男科缺陷
。
注释
3
：
高精液体积可以反映附属性腺分泌旺盛，可能存在活动炎症的情况。
15
2.3.4.1
参考值下限
精液体积的参考值下限为
1.5 ml
（
95%
置信区间（
CI
），
1.4-1.7
）。
2.3.5
精液
pH
值
精液
pH
值主要反映出由精囊腺分泌 的碱性液体和由前列腺分泌的酸性液体
之间的平衡情况。应在精液液化
30
分钟后进行 ，无论如何不要超过
1
个小时
，以
免因
CO
2
丢 失而影响检测结果，正常情况下选用范围在
6.0
到
10.0
之间的试纸。< br>
均匀搅拌样本
(
见框
2.3)
。
将一滴精液在
pH
试纸上均匀展开。
等待浸湿区域的颜色均匀一致（等候时间＜
30
秒）。
与标准带比色读出其
pH
值。
注：
pH
试纸的准 确性应该按照已知标准进行检测。对于粘稠的样本，可取小份
样本用专为测量粘稠溶液设计的
p H
量尺进行检测。
(Haugen
和
Grotmol, 1998)
。
2.3.5.1
参考值
对于生育男性精 液
pH
值的参考值尚未确定，现保持原有下限值
7.2
。
注释
1
：
如低体积低精子数目的精液样本的
pH
低于
7.0
，
可能存在生殖道梗阻或先
天性双侧输精管缺如（
CBAVD
）(de la Taille
等
, 1998; Weiske
等
, 2000; Daudin
等
, 2000; von Eckardstein
等
, 2000)
。同时也可能是精囊发育不良的一个表现。
注释
2
：
精液的
pH
值如随时间推移而升高，可能是由于自然缓冲物减少 ，所以高
pH
值不能提供有价值的临床信息。
2.4
显微镜初检
建议使用相差显微镜对所有未染色的新鲜精液标本进行检查，
初 检的总放大
倍数为
100
倍（即物镜
10
?和目镜
10?）
，对标本进行一般观察包括：
粘液丝；
精子凝集；
非精子细胞包括：
上皮细胞、圆形细胞（白细胞和未成熟精子细 胞）及断裂
的精子头部或尾部，这应在总放大倍数为
200
或
400
倍的条件下进行；
评估精子活力
(
见
2.5
节
)
；
根据精子计数要求决定稀释倍数
(
见
2.8
节
)
。
16
2.4.1
充分混匀精液和取样
充分均匀液化的精液本身就有利于解决化 验取样是误差的问题，
如样本不够
均匀，
观察同一份精液制备两份标本有关精子活动、
活力、
密度及形态等结果时
可能出现明显偏差，
为了给生育力的评估提供可靠 资料，
在检测前，
精液样本必
须充分混匀
(
见框
2.3)< br>，
两等份的数值必须相符才可接受测量结果。
两份标本经泊
松分类的精子数目（ 见框
2.7
和
2.10
，表
2.4
和
2.5
）和其百分率的二项分布（见框
2.5
和
2.6
，表
2.1
）需要一致。
框
2.3
充分混匀精液：
在取微量样 本进行检测前，
样本必须在容器内充分混匀，
力度要轻柔以免气
泡产生，可通过向样本 中插入一个宽孔（
直径接近
1.5mm
）的一次性无菌塑料吸
液管抽吸
10
次来达到混匀标本的目的。
不可用高速涡旋器，
以免对精子造成损伤。
2.4.2
湿片的制作
充分混匀精液样本（见框
2.3)
；
混匀后立即取样，以免精子在悬液中沉淀；
再次取样前还需进行混匀，
进行分析检查时精液体积和盖玻片的尺寸必须标
准化，
以保 持精子在固定厚度约
20?
m
条件下自由游动将
10?
l
的 定量精液滴在干
净载玻片上；
盖上
22mm
?
22mm< br>的盖玻片，形成近
20?
m
厚度，盖玻片的重量使标本均匀
展开；
应注意避免在盖玻片和载玻片之间产生气泡；
对新制成的湿片，
等到玻片上界面不再晃动时应尽快进行检测
。
框
2.4
湿片的厚度：
涂片的厚度（
D
?m
）是样本的体积（
V
，
?
l
=mm
3
）除以它的液面宽度（
A
，
mm
2
）
：
D=V/ A
。如，体积为
10
?
l
的精液置于一张洁净的载玻片上，加盖面积 为
22mm
?
22mm
的盖玻片
（面积为
484 mm2
）
，
则其厚度应为
20.7
?
m
；
若体积为
6.5
?
l
的样本上加盖一张
18mm
?
18mm
的盖玻片（面积为
324 mm
2
）
，则其厚度为
20.1
?
m
；如体积为
11
?
l
的样本上加盖一 张
21mm
?
26mm
的盖玻片（面积为
546
17
mm
2
）
，则其厚度为
20.1
?
m
；偶尔会出现大厚度的情况，如
40
?
l
的样本上加盖一
张
24mm
?
50mm
的盖玻片（面积为
1200 mm
2
）
，则其厚度为
33.3
?
m
；
注
1
：
涂片的深度小于
20
?
m
会限制精子的旋转运动
(Le Lannou
等
, 1992;
Kraemer
等
, 1998)
注
2
：
如厚度过大，则会因为精子在视野中来回运动而难以进行 精子评估。
注
3
：
如每一视野中精子的数目差异过大，则样本可能 是不具有代表性的。如出
现此种情况则应重新充分混匀精液标本（见框
2.3
）并按照 上述步骤重新制备一
张涂片。
注
4
：
欠缺代表性也可能会 导致粘稠度和液化的异常（见
2.3.1
节），精子的聚集
（见
2.4.3< br>节）或精子的凝集（见
2.4.4
节）。
2.4.3
精子聚集
不活动精子之间、活动精子与粘液丝之间、非精子细胞成分或细胞碎片等粘
在一起，为非特异性聚集（图
2.2
）
，这种情况应如实记录。
图
2.2
精液中精子的非特异性聚集
图示为精子与上 皮细胞（
a
），细胞残渣（
b
）及精子（
c
，
d< br>）的聚集现象。
显微图像由
C Brazil
提供
2.4.4
精子凝集
精子凝集是指活动精子以不同方式，头对头、尾对尾 或混合型，如头对尾，
彼此粘在一起。
剧烈震荡会使精子活力过度表现，
但有时由于凝 集会限制精子的
活动力。
任何精子的头部，
尾部或中段有粘附现象都应如实记录。凝集的类型
（反
应其程度
（
1-4
级）
）
和吸 附状态
（
A-E
级）
也应记录
（
Rose
等
, 1976
）
（见图
2.3
）
。
一级：轻度聚集指每个凝块中少于
10
条精子；
二级：中度聚集指 每个凝块有
10
到
50
条精子，精子运动自如；
18
三级：大片聚集指每个凝块有多余
50
条精子，精子仍然运动自由；
四级：整个精子聚集，所有精子聚集在一起彼此相互连接。根据程度又可分
a b c
d
。
注：
运动的精子粘附于细胞，
细胞碎片或是非运动的 精子
（聚集）
应该记为凝集。
图
2.3
精子聚集程度分类表
聚集等级
涉及部
分
完全分离
聚集精子数＜
10
个，
多数精子为游离
状态
中等聚集
聚集精子数
10~50
个，
有游离精子
高度聚集
聚集精子数＞
50
个，
部分精子游离
完全聚集
所有精子
均聚集一
团，无游
离精子
1
．轻度聚集指每个凝块中
少于
10
条精子；
2
．中度聚集指每个凝块有
1 0
到
50
条精子，精子运动自由；
3
．大片聚集指每个凝块有多余
50
条精子，精子仍然运动自由；
4
．整个精子聚集，所有精子聚集在一起彼此相互连接。
A
．头对头
B
．尾对尾
19
C
．尾端对尾端
D
．混合型
E
．纠结型
注释
1
：
存在凝集并不能 充分证实为不育的免疫性原因，但是能够说明有
抗精子
抗体的存在
；还需进一步检查以 明确诊断（见
2.20
节）。
注释
2
：
严重的精子凝集能够影响对精子活力和密度的评估。
2.4.5
其他非精子细胞成分
精液中常含有一定的非精子细胞成分，< br>部分与临床关系密切。
通常包括泌尿
生殖道上皮细胞、前列腺细胞、生精细胞和白细胞， 后两种统称为“圆细胞”
(Johanisson
等
, 2000)。这些细胞成分在染色后的涂片中（放大
1000
倍）难以区
别
(
见
2.12
节
,
表
13
和
14,
以及
2.19
节
)
。
可以通过过氧化物酶技术和全白细胞
单克隆抗原技术来进行鉴别。
非精子细胞成分计数用与精子 相同的方法进行，
或
根据染片
(
见
2.18.1.5
节)
中生精细胞或白细胞与精子的比例来进行计算。
（山东中医药大学第二附属医院生殖中心
董乾
江苏无锡妇幼保健院生殖中心
王洪华）
20
2.5
精子活力分析
精子活力程度 与妊娠率有关，电脑辅助法评估精子的运动性见第
3.5.2
节。
精子活力评估应在精 液样本液化后尽快（最好在
30
分钟之内）进行，务必在射
精后
1
个 小时之内进行。防止时间过长，因脱水、
pH
值及温度的变化对评估结
果产生的负面影 响。
过程如下：
?
将精液样本混匀。
?
拌匀后立即（防止精子沉淀）取出一等份。
?
重新搅拌精液样本的剩下部分，取出另一等份。
?
将上面的两份 样本分别滴大约
20?
m
深的湿制剂（见
2.4.2
节）的载玻片< br>上。
?
等到样本停止悬浮（
1
分钟以内）
。
?
用
200
或者
400
倍率的相差显微镜观察载玻片。
?
每个标本大概评估
200
个精子左右，以便算出各自不同类型精 子的百分
比。
?
若标本的观察值在可接受的范围，记录下数据，否则重新制作标本。
注
1< br>：
该过程应该在室温或者显微镜载物台预先加热至
3
7
℃的标准试验室 内
进行，如果在
37
℃下进行评估，精液样本需要放置在
37
℃环境 中一段时间，并
且制作标本的载玻片、盖玻片也应该预热至
37
℃。
注
2
：
建议采用带有网格标线的目镜以便选择观察区域，先数积极运动型精
子数量，
然后数非积极运动型精子数量，
最后评估完全不动型精子数量。
（见
2.5.1
节）
。
2.5.1
精子活力分类
建议采用一个简单的精液运动分类方法，该方法根据精子运动功能的不同分
成以下几类：
?
运动活跃型（
PR
）
：精子运动活跃、线性运动或者在 较大的范围内运动
（不考虑运动的速度）
。
?
非运动活 跃型
(NP)
：精子运动但不活跃，如精子在较小的范围内运动，
精子头部轻微移位或 尽有鞭毛摆动。
21
?
完全不动型（
IM
）
：精子完全不动。
注
1：
该手册之前的版本介绍的分类方法将积极活跃型根据精子运动速度的快慢
进行细分，如将 在
37
℃下精子运动速度大于
25
微米
/
秒的定义为
A
等，这种方
法存在的不足之处是实验人员很难客观准确的判断观察到的精子运动到底该归< br>到哪一等。
注
2
：
当讨论精子活动率时，细分精子的总能动 性（
PR+NP
）和活跃精子能动性
（
PR
）非常重要。
2.5.2
精液样本的准备和评估
如果在
37
℃
的温度下评估，提前
10
分钟开启恒温箱，以确保温度恒定在
37
℃
。
·
准备
20μm
深的计数板（见
2.4.2
节）
。
·
用
200
或者
400
倍率的相差显微镜观察载玻片。
·
等到样本停止悬浮。
·
在离盖玻片至少< br>5μm
的区域内观察精子的运动（盖玻片边缘的精子运动
性受到干燥物质的影响）
。
·
系统性地观察载玻片以防止重复观察同一个区域，不断改变观察区 域，避
免基于精子活动数量多少来选择观察区域（观察区域选择应该随机）
。
·
计数开始时间的选择应该随机，计数要迅速，不要等到精子游到所选区域
后才开始计数。
·
评估所选区域的所有精子的活动率，区域选择最好通过 目镜标线来确定，
选择区域的大小应根据精液的浓度，
如当精液浓度较大时，
选择最上 面一排网格，
浓度低时，选择全部的网格。
·
计数应该迅速，避 免运动精子的数量估计值比实际值多，快速计数网格内
的精子，
避免因计数时间过长，
将计数时游进网格的活动精子也计算入内而导致
估计值多于实际值。
·
< br>首先数所选区域内的运动活跃型精子（
PR
）
，然后是非运动活跃型精子
（
NP
）
，最后是完全不动型精子（
IM
）
。根据经验， 也可以同时计数一个网格内
的三种类型的精子然后再数另一网格内的三种类型的精子，直到将所选区域数
完。
·
通过实验室计数器的辅助完成计数。
·
每个标本至少在
5
个不同的区域计数，
所数的精子总数 应该不低于
200
个
22
以避免小样本错误。
分别计算两个标本的
PR
、
NP
和
IM
比例，然后计算各 自的均值和差值。
将计算的结果对照表
2.1
（在
95%
的置信区间内，
在某一均值下，
两个比例差
距可接受的最大值）
。
参照表
2.1
若两个比例差值在可接受范围之内，
记录
P R
、
NP
和
IM
比例的均
值，若差值过大，超过可接受范围 ，重新制作
2
个精液标本。
通过四舍五入记录
PR
、NP
和
IM
比例均值的整数值。
注
1
：仅计数完整的精子（有头部和尾部，见
2.7.3
节）不要计数只能看见小部
分的 精子。
注
2
：
活性精子计数时往往会多数，要通过改变计数顺序（ 如先数
NP
精子数或
IM
精子数）
，尽可能知到潜在影响计数的偏见 （见
7.13.3
节）并避免它们。
注
3
：
有时 ，样本不均匀，即使三个标本都不能得到可接受的差值，这时，记录
下两两的均值及差值。
< br>图
2.4
目镜标线对活性精子计数很有帮助（图
a
）
，系统性 地选择计数区域，
计数范围应该至少距盖玻片
5μm
（图
b
）
。
23
表
2.1
在某一均值下 ，
两个比例差距可接受的最大值
（每个标本计数
200
个精子的
情况 下）
。
框
2.6
：
关于百分比的比例值和差值处理
百分比要四舍 五入成整数，
若尾数是
0.5
则将其转换至离两者均值较近的整
数，如将32.5%
写成
32%
，而将
3.5%
写成
4%
。这些四舍五入成的百分比全部加
起来可能不等于
100%
。
对 照表
2.1
，若两个标本
PR
、
NP
、
IM
比例的差值刚好等于可接受的最大差
值，则接受该值。
若差值大于可接受的最大值 ，
一般认为是数错了、
吸取错误或者精液样本没
有搅拌均匀。
当差 值大于可接受的最大值时，
不要采纳之前的数据，
而应重新制作标本重
新计数。
（千万不要再做一份相同的标本，计算三个标本的平均值，或者选择数
据接近的两个计算平均值）。
2.5.3
示例
例
1
：
某两 份精液标本
（每个标本的精子数均大于
200
）
的精子能动性分析
如 下，
运动活跃型精子分别占
30%
和
50%
；
非运动活跃型 精子分别占
5%
和
15%
；
完全不动型精子分别占
65%< br>和
35%
。占比例最大的为完全不动型，它们的均值
为
50%
。对照表
2.1
，在均值为
50%
的情况下，差值大于
10%
，认为仅是偶然发
生事件。观察值大于
10%
（
65%-35%
）
，因此需重新制作两份标本进行评估。
例
2
：
某两份精液 标本
（每个标本的精子数均大于
200
）
的精子能动性分析
24
如下：运动活跃型精子分别占
37%
和
28%
；非运 动活跃型精子分别占
5%
和
6%
；
完全不动型精子分别占
6 0%
和
66%
，占比例最大的为完全不动型，它们的均值
为
63%< br>。对照表
2.1
，在均值为
63%
的情况下，两者差距大于
1 0%
，认为仅是偶
然发生事件。观察值小于
10%
（
66%-30%
）
，因此，接受该观察值，并记录如下：
运动型精子占
32%
，非运 动型精子占
4%
，完全不动型精子占
63%
。
2.5.4
参考下限
总运动精子（
PR+NP
）
比例的参考下限为< br>40%
（
95%
的可信度，
38-42
的可
信区间）
；
积极运动精子（
PR
）比例的参考下限为
32%
（
95%
的可信度，
31-34
的可信区间）
。
注：一次射精的精液中的运动活跃型精子总数具有生理上的意义，它的值
等于精液中的总精子数乘以运动 活跃型精子的比例。
2.6
精子活率
精子活率的评 估通过精子细胞膜的完整性程度来完成，
通常每个样本都可以
评估其活率。
尤其当积极 活跃型精子比例小于
40%
时，
评估精子活性就非常必要
。
这时，< br>精子活性评估可以检验精子能动性评估的正确性
，
因为死亡精子的比例不
应该超 过完全不动型精子的比例，存活精子的比例应该超过运动精子的比例。
别举活精子的比例通过 评估精子细胞膜的完整程度来完成，
而细胞膜的完整
程度评估运用染色排除法或低渗透肿胀法。
染色排除法基于以下原理：
损坏的细
胞膜，例如死亡细胞膜，允许有色物质进入；渗透 肿胀法则假设：在低渗透压溶
液中只有拥有完整细胞膜的细胞才会肿胀。下面将会对这两种方法分例。< br>
精子活率的评估应在精液样本液化后尽快（
最好在
30
分钟之内）进行，务
必在射精后
1
个小时
之内完成。
防止时间过长，因脱水及温度的变化对评估结果
产生的负面影响。
注
1
：临床上，知道完全不动型精子是否是活的非常有必要，因此，
精子活率的
评估要在精子能动 性评估结果的基础上进行。
注
2
：
若出现完全不动且为活性精子的 比例较大的情况，则提示精子鞭毛存在结
构性缺陷；若完全不动且为死亡精子比例较大则提示附睾存在病 理。
2.6.1
曙红（伊红）－苯胺黑法评估精子的活率
这种 方法通过
苯胺黑染色剂
，
只需要一个步骤，
增强精子头部颜色与背景颜
25
色的对比度，
很容易就可以看出精子是否具有活率。
将染色后的精 液制成标本放
到显微镜下观察。
2.6.1.1
准备试剂
1.
曙红
Y
：将
0.67
克曙红和
0.9
克氯 化钠溶入到
100
毫升纯净水中，并轻微
加热。
2.
曙红 —苯胺黑：将
10
克苯胺黑加到配好的
100
毫升的曙红
Y
试剂中。
3.
将其加热至沸腾，然后冷却至室温。
4.
用滤纸（如
90g/m
2
）滤掉渣滓及凝胶状沉淀物，然后存储于
黑色密封的
玻
璃瓶内。
2.6.1.2
步骤
1.
将精液样本拌匀。
2.
将
1/5
的精液
与
5
μ
l
伊红溶液混合，
置于显微镜载玻片上，
用移液管 混匀，
在载玻片上均匀展开。
3.
重新搅拌精液样本，然后重复步骤
2
制作另外相同一份。
4. < br>将两份样本的悬浮液分别涂抹在不同的载波片上（见
2.13.2
节）
，然后置
于空气中风干。
5.
标本干后立即观察，或者将其置于永久非水介质（见
2.14.2.5
）中，以后
再观察。
6.
用
100
倍的油浸物镜观察。
7.
在实验室计数器的辅 助下，计数已被染色的精子（死亡精子）和没有被
染色的精子（活性精子）数量。
8.
为了避免样本错误，每个标本至少要数
200
个精子。
9
．分别计算
两个标本活性精子的比例，以及两者之间的差值
。
10.
对照表
2.1
（在某一均值下，两个比例差距可接受的最大值）以确 定差
值是否可以接受。
11.
若均值可以接受，记录下两个标本活性精子 比例的平均值，否则，重新
制作两个相同的标本并且重复以上步骤。
12.
用四舍五入法记录所得的比例值。
图
2.5
在明场视野镜下观察曙红—苯胺黑精液标本图
头部变红的 精子（
D1
）或者暗红（
D2
）的精子认为是死的（细胞膜受损）
；
头部为白色（
L
）或者淡粉色的精子认为是活的（细胞膜完整）
。
26
2.6.1.3
计数
1.
苯胺黑使整个标本的背景成为黑色，因此容易分辨被染色的与未被染色
的精子。
2.
在明场视野显微镜下，活精子具有白色头部，而死精具有红色或暗红色
头部（见 图
2.5
）
,
淡红色头部的精子认为是活的。
3. 如果精子头部仅有小部分被染色，认为是颈膜泄漏，不是细胞死亡和全
部膜破坏的迹象
。这 种情况下认为该精子是活的
。
2.6.1.4
正常参考下限
< br>活精子（细胞膜完整精子）比例的参考下限为
58%
（置信度为
95%
，置信
区间为
55-63
）
。
注：
一次射精量中 （见
2.8.7
节）
，精子细胞膜完整的精子总数具有生理学意义，
可以通过 精子总数乘以具有完整精子细胞膜的比例得到。
2.6.2
仅用曙红（伊红）染料评估精子活力
该方法简单快速，但所制备湿片无法储存以用于质量控制。
2.6.2.1
试剂的制备
1. NaCl
，
0.9%
（
w/v
）
：将
0.9g NaCl
溶于
100ml
净化水中。
2 .
曙红
Y
染剂，
0.5%
（
w/v
）
：将
0.5g
曙红
Y
（比色指数，
45380
）染料溶于
100ml
浓 度为
0.9%
的
NaCl
溶液中。
注：
一些商用 曙红溶液是会对精子结构造成破坏的低渗溶液，
这会造成假阳性结
果。如果使用这种溶液，需向
100ml
溶液中添加
0.9g
的
NaCl
以提高 渗透压
。
27
2.6.2.2
操作步骤
1.
充分混匀精液样本（见框
2.3
）
。
2.
吸取
5
μ
l
的精液样本，
同
5
μ
l
的 曙红溶液在载玻片上混匀。
可使用移液器
头在载玻片样本上充分搅拌以保证混合均匀。
3.
用
22mm
?
22mm
的盖玻片覆盖，反应
30
秒。
4.
重新混匀精液样本，重新吸取样本，重复上述步骤
2
和
3
。
5
检验所制备的玻片，
以放大倍数为
200
或
400
倍的负相位光学显微镜
（正
相位目镜难以辨明染为淡粉色的头部）检验为佳。< br>
6.
用实验室计数器来计数染色（死亡）和非染色（存活）细胞的数目。
7.
为了达到可接受的低样本误差，每张玻片评估
200
个
精子（见框
2.5）
。
8.
统计所制备的两张玻片中活动精子的平均数和百分率的差异。
9.
以表< br>2.1
或是图
A7.2
，附录
7
为标准（在仅考虑样本误差的 前提下，均
显示
95%
的样本其两个百分率的最大差异是可以接受的）
，推断 是否为可接受的
差异。
10
．如果其百分率上的差异是可以接受的，则可报 告其活力的平均百分比。
如果差异过高，则重新制备标本再次进行评估（见框
2.6
）
。
11.
所报告的精子活力的百分比应尽可能涵盖所有的精子数目。
2.6.2.3
计分
1.
存活精子的头部染色为白色或淡粉色，死亡精子的头部染色为红色或深
粉色。
2.
如果染色仅限于颈部区域，剩余的头部未染色，则可认为是“颈部细胞
膜不全”
，这并非是细胞死亡和细胞膜崩解的标志，此类细胞应被认为是存活细
胞。
3.
如果难以辨识浅染的头部，可使用苯胺黑以增加背景的对比度
(
见2.6.1
节
)
。
2.6.2.4
正常参考下限
活精子（细胞膜完整精子）比例的参考下限为
58%
（
置信度为
95%
，置信
区间为
55-63
）
。< br>
注：
一次射精量中（见
2.8.7
节）
，精子细胞膜完整的 精子总数具有生理学意义，
可以通过精子总数乘以具有完整精子细胞膜的比例得到。
28
2.6.3
活精子的
低渗膨胀检验
作 为一种可供选择的染色排除方法，
低渗膨胀
（
HOS
）
检验可以用于 评估精
子的存活情况（
Jeyendran
等，
1984
）
。当无法进行染色时，如选择用于
ICSI
的
精子，
该法为最有效地评估方法 。
细胞膜完整的精子在低渗介质中会于
5
分钟膨
胀，且其形状会在
3 0
分钟内保持稳定
(Hossain
等
, 1998)
。
使用方法：
?
如为常规诊断用途可孵化
30
分钟
?如果为治疗目的则只可孵化
5
分钟
2.6.3.1
试剂制备
1.
用于诊断的膨胀液的制备：
将
0.735g
二水柠檬酸钠和
1.351g
右旋果糖溶
于
100ml
的净 化水中。该溶液需保存于
-20
℃的环境中。
2.
如用于治疗用途 ，以
1+1
（
1
：
2
）的比例用无菌净化水溶解介质。
2.6.3.2
操作步骤
1.
使用前溶解膨胀液充分混匀。
2.
以
37
℃密闭的微型 离心管中加热
1ml
的膨胀液或
1+1
（
1
：
2< br>）的稀释媒
介
5
分钟。
3.
充分混匀样本（见框
2.3
）
。
4. 吸取
100
μ
l
的精液样本并添加膨胀液。用移液器缓慢抽吸混匀。
5.
37
℃下准确孵化
5
分钟或
30
分钟 （见上）
，之后取
10
μ
l
液体置于洁净的
载玻片上，加盖
22mm
?
22mm
的盖玻片。
6.
按上述步骤，再次混匀精液样本，再次吸取标本，混入膨胀液，孵化，
再次制备涂片。
7.
用放大倍数为
200
或
400
倍的光学显微镜检测涂片。
8.
用实验室计数器辅助计数未膨胀（死亡）和膨胀（存活）的细胞数目。
9.
为了保证较低的样本误差，每张涂片计数
200
个精子（见框
2.5
）
。
10.
统计所制备的两张玻片中活动精子的平均数和百分率的差异。
11.
以表
2.1
或是图
A7.2
，附录
7
为标准（在仅考虑样本误差 的前提下，均
显示
95%
的样本其两个百分率的最大差异是可以接受的）
，推 断是否为可接受的
差异。
12.
如果其百分率的差异是可以接受的，则可 报告其活力平均百分比。如果
差异过高，则重新制备标本再次进行评估（见框
2.6
）
。
13.
所报告的精子活力的百分比应尽可能涵盖所有的精子数目。
29
2.6.3.3
计分
1.
通过细胞形状的改变来确认膨胀的精子 ，如显示为尾部卷缩（图
2.6
）
。
2.
精子尾部有膨胀 表现则可认定为存活精子；
将所有尾部膨胀的精子均计为
存活精子。
图
2.6
低渗膨胀状态下的人类精子的典型形态变化表现示意图
（
a
）无变化
（
b
）—（
g
）不同的尾部变化
灰色区域提示为肿胀的尾部。
2.6.3.4
正常参考下限
HOS
检验的参考值接近于曙红检验的参考值（
Ca rreras
等，
1992
）
。活性精
子
（细胞膜完整精子 ）
比例的参考下限为
58%
（
置信度为
95%
，
置 信区间为
55-63
）
。
注释：
一次射精的精液中的精子 细胞膜的完整性的总数目是有生物学意义的。
细
胞膜完整的精子数目可通过一次射精的总精子数 乘以细胞膜完整精子的百分率
来获得。
2.7
精子计数
每次射精时精子的总数和精子浓度均与妊娠的时间
(Slama et al., 2002)
及妊娠
率
(WHO, 1996; Zinaman et al., 2000)
有关，可通过其预测受孕
(Bonde et al., 1998;
Larsen et al., 2000)
。此推论已为生殖率与精子总数之间关系的诸多资料所证明。
射精时精子 的数量，是由鉴定精液得出的精子密度来统计。对于正常射精，
当男性生殖道是通畅的且禁欲时间短，< br>每次射精时的精子总数均与睾丸容积有关
(Handelsman
等
, 1984; WHO, 1987; Andersen
等
, 2000; Behre
等
, 2000)
，
所以，
精
子总数是衡量睾丸成生精子的 能力
(MacLeod & Wang, 1979)
及男性生殖道通畅的
指标。与受 精和妊娠率相关的精液中精子浓度受精囊
(Eliasson, 1975)
和前列腺分
泌多少的影响，并非是睾丸功能的特异性指标。
注释
1
：
“精子总数”一词与“精子密度”一词并非同义词。
“精子密度”指
30
的是每单位体积精液中精子的数量，是射出的精子数目与液体稀释体积的函数。< br>“精子总数”
指的是一次射精时全部精液中的精子总数，
由精子密度乘以精液体
积获得。
注释
2
：
一般说来，一次射出时的精子总数反映了睾丸的 生精能力，但脊髓
损伤、雄激素不足、延长禁欲后采集的样本或不完全逆行射精的病患则是例外。
注释
3
：
当精子密度（每单位体积的数）有意义时 ，
“精子密度（每单位体积
的量）
”一词不应使用。
精子计数的确定包括以下步骤（后续的细节章节有详解）
：
?
< br>在载玻片上涂抹液化后未稀释的混匀精液样本，覆上盖玻片进行检验，
以确定适于使用的稀释度和 计数池（见
2.8.1
）
。这即是通常用于鉴定活力的湿片
（见
2. 4.2
）
。
?
将精液与加入固定剂的稀释液混合。
?
让精液充填血细胞计数器的一个计数池。
?
10
－15
分钟内评估样本（干燥后会在数精池内出现明显精子痕迹）
。
?
每次重复至少计数
200
条精子。
?
比较每次重复的计数以了解其是否在可接受的误差范围。如是，则继续
计 算；如否，则准备新的稀释。
?
计算每
ml
精子密度。
?
计算每次射精的精子总数。
2.7.1
计数池类型
推 荐使用
100
μ
m
深血球细胞计数器为计数池，因
Neubauer
（牛鲍氏）血球
细胞计数器改良后的稀释因素更适宜。
使用另外深度的血细胞计数器计 数池，
有
着不同的深度和网格模式，
要求不同的计数因子。
所使用的计数池对 决定精子密
度是有效的
(Seaman
等
, 1996; Mahmoud
等
, 1997; Brazil
等
, 2004b)
，但改良后的
Neubauer
血球细胞计数器得到的结果将会不同。通过毛细管作用填充的 浅计数
池，由于流动精子不会均匀分布
(Douglas- Hamilton
等
,
2005a,
2005b)
。该误差能
够被校正
(Douglas-Hamilton
等
,
2005a)
，但校正并非是完全正确的
(Bj?
rndahl
&
Barratt
，
2005)
。这种可选择的计数池，其有效性须经计数池核 查量纲来确定
(
见
附录
7,
A7.8
节
)
，将
Neubauer
改良的血细胞计数器法得出的结果加以比较，获
得如客观的质 量控制程序所显示出的满意操作性能。
为实现低密度精子的精确鉴
定，需采用大容积的数精池< br>(
见
2.11.2)
。
2.7.2
改良的
Neubauer
（纽鲍尔氏）血球细胞计数器
改良的Neubauer
血细胞计数器有两个隔开的计数池，
每个计数池均在玻片上
gr idlines
蚀刻出显微镜下可见的
3 mm ×
3 mm
模式，
采用专用的厚载玻片
(
厚度
4
31
号
, 0.44 mm)
，
由
0.1 mm
玻璃柱支撑，
覆盖网格。
每个计数区分成九个
1 mm ×
1
mm
网格。这些网格见图
2.7
中数字所示。
图
2.7
改良的
Neubauer
（纽鲍尔氏）血球细胞计数器
蚀刻 区略图如下所示：血球细胞计数器计数池的所有九个网格（左边面板）
；
25
个大方格 中的中央网格
（
5
号）
（中间面板）
；
显微镜下已充填的一 个数精池的
部分（右边面板）
，即中央网格的
25
个方格之一（中间面板的圆 圈所示）
，其由
三重线围出，包含
16
个小方格。
2.7.3
血球细胞计数器网格的使用
?
只对整个精子（包括头和尾）进行计数。
?
以精子头部位进行计 数；尾的定向不重要；方格的边界由三线的中间线
标明，
所以，
需统计精子头的大部分 是否位于两条内线之间，
而并非大部分头部
在两条外线之间
(
图
2. 8,
左面板
)
。
?
为避免毗邻方格内的同一 精子的重复计数，头部位于划分两个毗邻方格
的线上的精子，
应只计两条垂直界线之一上的精子 。
例如，
精子大部分的头部低
于
L
型
(
见图
2.8,
中间面板
)
中央界线或在其左边的，
可计数，
而中央界 线上方或
右边的不予计数（见图
2.8,
右边面板）
。
注意：
如果有头部缺失的精子尾（针头）或无尾精子，在报告中应记录。若
有需要，其浓度应通 过与正常精子计数同样的方法进行评估
(
见
2.8)
，或其在精
子中 的比率可由染色法确定
(
见
2.17.6)
。
2.7.4
计数器的维护
血球细胞计数器计数池须用专用的厚盖玻片
(
厚度
4
号
, 0.44 mm)
。
?
使用后，用水清洗血细胞计数器数精池和 盖玻片，然后用相机（镜头）
专用纸充分干燥，
这样可避免干燥后的任何杂质残留。
摩 搓网格方格可除去先前
样本的任何残留物。
?
在消毒剂中过夜浸泡可重复使用的数精池和盖玻片
(
见附件
2, A2.4
部分
)
，
避免污染精液中潜在的传染因子。
三线的中间线确定了方格的边界（黑线，左边面板）
。除头部在两条内线之
32
间（白圈）的精子之外，方格中央的所有精子均计数，但头部在两条外线之间的
需计数（黑圈）
。头部大部分在中间线上的精子，
如果该中线低于方格（白圈，
中间面 板）或是方格的左手线，
则精子需计数，但如果该中线高于方格（黑圈，
右边面板）或是方格的 右手线则不计数。
图
2.8
网格方格内计数的精子
2.7.5
稀释后精液的固定
1
．
1000mL
纯水中溶解
50g NaHCO
3
和
10 ml 35% (v/v)
甲醛溶液。
2
．如果急需，加
0.25 g
台盼蓝（颜色所引
23859
）或
5mL (>4 mg/ml)
饱和的
结晶紫（颜色所引
42555
）
，以加亮精子头部。
3
．
4°
C
贮藏。若溶液中是以结晶形式存在，使用前用
0.45 -
μ
m
过滤器过滤。
2.7.6
计数足够数量精子的重要性
为降低样本误差，精子的临界数量（大约
200
条重复计数时，总数
400
条以
上更合适）
（见框
2.7< br>和表
2.2
）
。
框
2.7
估计数值时的误差
精子数目的估算精度依赖于所计数精子的数目。在泊松分布中，计 数（
N
）
的标准误差（
SE
）是单位体积精液中精子数目的平方根（ √
N
）
，其
95%
的置信
区间（
CI
）接 近
N
±
1.96
?√
N
（或为
N
±
2
?√
N
左右）
。
如果计数
100
个 精子，那么标准误差（
SE
）即为
10
（√
100
）
，其
95%
的置
信区间
（
CI
）
是
80 -120
（
100
±
20
）
。
如果计数
2 00
个精子，
则
SE
为
14
（√
200
）
，
其
95%CI
为
172-288
（
200
±
28
）
。如果计数
400
个精子，则
SE
为< br>20
（√
400
）
，
其
95%CI
为
360-440
（
400
±
40
）
。
样本误差一般表达为计数的百分比（
100
?（√
N/N
）
）
。详见表
2.2
注意：
这些评估仅是大致，因为评估时可信度的间隔不会总是均匀 。基于泊
松分布的精确的
95%
可信度间隔，一次计数
400
条时为
361-441
条；一次计数
100
条时为
81.4
–121
条；一次计数
10
条时为
4.80
–
18.4< br>；一次计数
1
条时为
0.03
–
5.57
；一次计数
0
条时为
0.00
–
3.70
。
33
表
2.2
参照精子计数总数的圆形样本误差（
%
）
注释
1
：
太少的精子用于计数，将会得出不可确信的结果（见附录
7
，
A 7.1
节）
，对诊断和治疗产生影响
(
见附录
7,
A7. 2)
。当精子用于治疗目的以及精子数
量少时，这现象不可避免（见
5.1
节 ）
。
注释
2
：
当精液量少以及用于计数的精子少于推荐量 时，所获得的数据的精
确度将显著下降。如果每次重复少于
200
条精子，报告样本误 差见表
2.2
。
（广西南宁第二医院
生殖中心
刘峰）
34
2.8
常规计数程序
如果在计数池
4
、
5
和
6
大方格或是其中之一中有大约
200
条精子，那么按
1 + 4 (1
：
5)
和
1 + 19 (1
：
20
）稀释是合适的（见表
2.3
和
框
2.8
）。
框
2.8
每次重复计 数时改良纽鲍尔氏计数池中央
3
个大方格的精子数达到
200
。
在初始的湿片制备中，如果容积为
4 nl
的每高倍视野（参阅
2.9
）有
100
条
精子，理论上精子密度为
25/ nl (
25 000/μl
或
25 000 000 /ml)
。
< br>由于改良纽鲍尔
氏计数池的中央大方格
（
5
号方格）
容积是< br>100 nl
，
则其内的精子数目将是
2500
。
以
1 + 4 (1: 5)
倍数稀释样本将会调整每个大方格精子数量为
500
，这样可获得足够低的抽样误差。
在初始的湿片制备中，如果每高倍视野有
10
条精子 ，则精子密度是
25/nl
，
中央大方格的精子数目是
250
。建议 以
1 + 1 (1: 2)
倍数稀释样本将会调整每个大
方格精子数量是
1 25
。同样，这可获得足够低的抽样采样误差。
注：
由于计数的精子数目太 少和计算的容积可能不太准确，
上述浓度计算只是粗
略的估计。未稀释精液样本浓度估计大约是 稀释精液样品计数浓度的
30
％至
130%
。
2.8.1
确定所需的稀释度
如果要准确测量未稀释精液样本的精 子数量，
将精液予以稀释是必要的，
这
种方法也通常用于在湿片制备中评测精子活力（ 请参阅
2.4.2
节）。
?
如
2.4.2
节中所述制作湿片并检测其中之一，估计每高倍视野
(
?
200
或?
400)
的精子数。
?
每高倍视野大约相当于
16 nl (
在
?
200)
或
4 nl (
在
?
400
）的容积（请参
阅
框
2.9
）。
?
如检测到精子，
则按照
2.8.2
节的步骤予以计数，
并根据表
2.3
确定需要的稀释
度。
?
如果检测不到精子，则检测另一湿片。如果在第二张湿片中仍没有检测 到精
子，按照
2.9
节的步骤进行。
框
2.9
池深为
20
μ
m
的湿片中每高倍视野的容积
35
每个显微镜检测视野包含的精液量取决于该区域的面积
（
π
r
2
，
其中
π
大约
是
3.14 2
，
r
为显微镜检测视野的半径）
和池的深度
（湿片制备中大约是< br>20.7
μ
m
）
。
显微镜视野的直径可以用镜台微尺测量，< br>或可以通过目镜的光圈直径除以物镜的
放大倍数来估算。
如使用?
40
的物镜和口径为
20 mm
?
10
目镜，则显微镜视野的直径大约
500
μ
m(20 mm/40)
。
这种情形下，
r = 250
μ
m
，
r
2
= 62 500
μ
m
2
，
π
r
2
= 196 375
μ
m
2
，而该区域的容积是
4 064 962
μ
m
3
或大约
4 nl
。
如使用?
20
的物镜和口径为
20 mm
?
10
目 镜，则显微镜视野的直径大约是
1000
μ
m(20 mm/20)
。
这种情形下，
r = 500
μ
m
，
r
2
= 250 000
μ
m
2
，
π
r
2
= 785 500
μ
m
2
，而该区域的容积是
16 259 850
μ
m
3
或大约
16nl
。
表
2.3
精液所需稀释度、配制方法、使用的计数板和评估区域
每?
400
视野的精
子数
>101
16-100
2-15
<2
每?
200
视野的精
子数
>404
64-400
8-60
<8
1
：
20
（
1+19
）
1
：
5(1+4)
1:2(1+1)
1:2(1+1)
所需稀释度
所需
精液量
50
50
50
50
所需
固定液
950
200
50
50
使用的
计数板
评估
区域
（
μ
l
）
（
μ
l
）
改良纽鲍氏
方格
5
、
4
、
6
改良纽鲍氏
改良纽鲍氏
改良纽鲍氏
改良纽鲍氏
改良纽鲍氏
或更大容积
整块玻片的
9
个方格
注
1
：
白细胞移液管和依靠空气置换原理的自动移液管并不足以将 粘性精液准确
稀释，建议使用正向置换型移液管。
注
2
：
就诊断而言，用于分析的精液样本不应小于
50
μ
l
，以避免因小容量样本
而造成的抽样误差。
注
3
：
如在推荐的稀释倍数下每视野可见的精子数目太少，则以更低的稀释倍数< br>制备另一个湿片。
如在推荐的稀释倍数下每视野有太多的重叠精子，
则以更高的
稀释倍数制备另一个湿片。
注
4
：
如果
1 + 19 (1: 20)
稀释不合适，则使用
1 + 49 (1: 50)
稀释。
注释
1
：
如果初始湿片制备中精 子数目太低
(
每?
400
高倍视野
<4
：大约
1< br>?
10
6
/ml)
，此时可不要求计算准确的精子数量（请参阅
2.10
）。
注释
2
：
为准确评 估低密度精子（每?
400
高倍视野
<2
：大约
0.5
?< br>10
6
/ml)
，建
议对改良纽鲍尔氏计数池板的
9
个大方网格全部计数
（请参阅
2.11.1
）
，
或使用
36
大容量的一次性计数板进行荧光检测（请参阅
2.11.2
）。
2.8.2
稀释精液并加样于血细胞计数池
?
吹打使血细胞计数池表面微微湿润。
?
将盖玻片紧压支持柱以固 定于计数池上，可通过观察两层玻璃之间的虹彩
（多重
Newton
环）来确认盖玻 片是否正确置放：光线越多，位置越合适；
如只有
1-2
条光线则提示计数池深浅不一 。
?
采用正向置换型移液管将适量的固定剂（见表
2.3
）分配到两个稀释瓶中。
?
将精液样本混匀（请参阅
框
2.3
）。
?
混匀后立即吸入适量的精液，以避免精子从悬浮液中沉降（见表
2.3
）。
?
将移液管尖端的精液擦拭干净，小心以避免碰到尖端的开口。
?
将精液加入固定剂中，反复吸压以洗刷移液管尖头部。
?
重新将精液样本混匀，按以上步骤重复另一份稀释。
?
将第一次稀释的液体置于振荡器以最高的速度振荡
10
秒钟以充 分混匀，立
即吸取大约
10?
l
的悬浮液以避免精子沉降。
?
将移液管尖端仔细触碰其中一个计数池
v
型槽的下缘。
?
慢压移液管枪栓，通过毛细管作用使样本充满计数池。在充池过程中盖玻片
不应有移动，且计数池不应过满（此时可看到盖玻片有移动）或不满（此时
可见计数池内有气泡）。< br>
?
如上将第二次稀释的液体混匀，
并立即吸取
10?l
悬浮液。
重复以上步骤对另
一计数池充池。
?
< br>将血细胞计数板平放置于湿盒内（例如放在浸透水的过滤纸上并盖上皿）以
免干燥，在室温下储存 至少
4
分钟。这段时间不动的细胞将沉淀在方格内。
注
1
：
有些计数池是由磨砂玻璃支持柱构成，此时将不出现
Newton
环。在每侧的磨砂玻璃支持柱边滴注
1.5?
l
的水可使盖玻片保持其位置不变，但小心不要 让
水渗入计数区域。
注
2
：
使用血细胞计数板夹
保持盖玻片位置不变将确保一个固定的池深
(Christensen
等，
2005
年
)
。
注
3
：< br>对于非常粘稠的精液样品，如果混匀过程延迟
5
–
10
秒钟，则精液可 在稀
释液中凝集。
遇到这种情况，
应在精液添加入固定液后立即旋涡式搅拌
1 0
秒钟。
37
2.8.3
在计数池中检测精子数量
均应在两个血细胞计数池中检测精子数量。
如果两 个检测值充分一致，
其值
可信
(
参阅第
2.4.1
节
)
。
?
在?
2 00
或?
400
放大倍数的光学相差显微镜下检测血细胞计数池。
?
每次至少重复计数
200
个精子以达到足够低的抽样误差（请参阅
框
2.7
和
表
2.2
）。
?
首先对其中一个改良纽鲍尔氏计数池的中央大方格（图
2.7
中的
5
号）逐
行进行计数。
?
< br>继续计数直到至少
200
个精子和完整的一行
(
包括
5
个中方格）
。
计数必须包
括完整的一行，不能在一行的中间停止。如果在中央大方格 的
5
行中计数不
够
200
个精子，继续在两个相邻大方格（图
2.7
第
4
和
6
号
)
的各行中(
每行
包括
4
个中方格）计数。
?
将计数达到至少
200
个精子所需要的行数予以记录，
检测另一计 数池时也要
在相同的行数内计数。
?
借助实验室计算器计算精子的数目和行数。
?
切换至另一计数池，重复计数与第一次相同的行数（相同体积），即便计数
结果少于
200
个精子。
?
计算两次计数的总数和差异值。
?
根据表
2.4
或附录
7
图
A7.1
确定差异的可 接受性
(
均显示在
95%
的可信区
间内，单纯抽样误差允许的两个数 值的最大差异值。
)
。
?
如果差异可以接受，则计算精子密度
（请参见
2.8.4
）；如果差异太大，则
如章节
2.8.2
所述重新进行双份稀释并重新计数（请参阅框
2.10
）。
?
取两个有效数值的平均值作为精子密度予以报告。
?
计算每次射精的精子总数
(
参阅
2.8.7
节
)
。
注
1
：
如果在
4
、
5
和
6
号大方格中计数少于
200
个精子，
不要继续在
1
、
2
、
3
、
7
、
8
或
9
号大方格中计数，因为这些大方格中每行的容积不同于
4
、
5
和
6
号大方格
(
参阅
2.7.2
节
)
。这种情况下，可降低稀释倍数进行双份稀释和计数。
如果需要
1 + 1 (1: 2)
稀释，则按章节
2.11
的步骤进行。
注
2
：
对同一计数池进行两次计数或对同一次稀释填充的两个计数池进行计数都
38 < br>不是真正的重复计数，
因为这样并没能对采样、
混合及稀释所造成的误差进行检
测。
框
2.10
重复计数的比较
两个相对独立数值的理想差异值为
0
，其标准差等于两个数值之和的平方
根。 因此在
95%
的可信区限内
(N1
–
N2)/(
√
(N1+N2))
应该小于
1.96
。
如果两个数值之间的差异值小于或等于表
2.4
或表
2 .5
给出的数值，
则评估
可被接受，精子密度可计算为两个数值的均值。
< br>较大的差异值则意味着可能发生计数差误、采样失误或者精液没有充分混
匀，导致在计数池间或计 数池内存在非随机分布。
当两个数值之间的差异值大于可接受值时，
应放弃先前的这 两个数值，
重新
准备两次新的精液稀释并予以评估。
（不要尝试第三次计数，
并计算这三个数值
的平均值或最相近的两个值的平均值
)
。
这适用 于精子和过氧化物酶阳性细胞（请参阅
2.18
）的计数。对于
CD45
阳< br>性细胞（请参阅
3.2
）和未成熟生殖细胞
（请参阅第
2.19
），应该做好染色准备
后重新评估。
采用
95%
的可信区限，大约有
5%
的重复计数会因单纯的随机误差而被排除
在界限外。
注：
在极少数的非均匀性精液样本，
甚至第三次重复计 数显示的差异值也是不可
接受的。这种情况下，计算所有数值的平均值并予以报告。
39
表
2.4
两次重复计数的不同总数所允许的差异值
总数
可接受差异值
*
总数
可接受差异值
*
144-156
157-169
170-182
183-196
197-211
212-226
227-242
243-258
259-274
275-292
293-309
310-328
*
基于
95%
的可信区间
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
329-346
347-366
367-385
386-406
407-426
427-448
449-470
471-492
493-515
516-538
539-562
563-587
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
2.8.4
计算精液中的精子密度
建议计算和报告精液中的精子密度。
虽然精子密度不是反应睾丸功能的特异
指标，但与 受精率和妊娠率相关。
精液中的精子密度是指精子总数（
N
）除以计数精子 所在的精液体积，即重
复计数的总行数（
n
）的容积（大方格
4
，< br>5
和
6
中每行容积相当于
20nl
），再乘
以稀释倍 数。其计算公式为：
C
= (
N
/
n
)
?
(1/20)
?稀释倍数。
?
对于
1+4 (1:5)
稀释，
在大方格
4
，
5< br>和
6
中计数时，
精子密度
C
= (
N/n
)
?
(1/20)
?
5
个精子
/nl
或
C
= (
N/n
)
?
(1/4)
精子
/nl (
或
10
6
/ml )
。
?
对于
1+19 (1:20)
稀释，
在大方格
4
，
5
和
6
中计数时，
精子密度
C
= (
N/n
)
?
(1/20)
?
20
个精子
/nl
或
C
= (
N/n
)
精子
/nl (
或
10
6
/ml )
。
40
?
对于
1:50 (1+49)
稀释，
在大方格
4
，
5
和
6
中计数时，
精子密度
C
= (
N/n
)
?
(1/20)
?
50
个精子
/nl
或
C
= (
N/n
)
?
2.5
精子
/nl (
或
10
6
/ml )
。
2.8.5
示例
例
1
：
1 + 19 (1
：
< br>20
）稀释下，第一次计数时在
7
行内发现有
201
个精子， 第
二次计数时在
7
行内发现有
245
个精子，总计数是在
1 4
行内有
446(201 + 245)
个精
子，差异值是
44(2 45
–
201)
。从表
2.4
中可以看出这个值已经超出 了偶然概率所
允许的差异值（
41
），因此需要重新双份稀释
。
例
2
：
1 + 19 (1
：
20
）稀释下，第一次计数时在
4
行内发现有
220
个精子，第
二次计数时在
4
行内发现有
218
个精子，总计数是
8行内有
438(220+218)
个精子，
两组差异值是
2(220–
218)
。从表
2.4
中可以看出这个值小于偶然概率所允 许的
差异值（
41
），因此计数获得认可。
1 + 19 (1: 20)
稀释下样本的精子浓度为
C
= (
N/n
)
?
1.0
个精子
/nl
，即
(438/8
）
?
1.0 = 54.75
个精子
/nl
或
55
?
10
6
精子
/ml(
就这两个有效数值而
言）。
注：
1 + 19 (1
：
20
）稀释并在大方格
4
、
5
、
6
内计 数，精子密度很容易计算。
计数的精子总数除以行数等于精子密度?
10
6
/ ml
。上面示例中精子密度计算为
(220+218)/(4+4) = 438/8 = 55
?
10
6
/ml
。
例
3
：
1 + 19 (1
：
20
）稀 释下，第一次计数时在
15
行内发现有
98
个精子，第
二次计数时在
15
行内发现有
114
个精子，总计数是
30
行内有
212(98+114)
个精子，
差异值是
16(114
–
98)
。
从表
2.4
中可以看出这个值小于偶然概率所允许的差异值（
29
），因此计数获得认可。
1 + 19 (1: 20)
稀释下样本的精子浓度为
C
= (
N/n
)
?
1.0
个精子
/nl
，即
(212/30)
?
1.0 = 7.07
个精子
/nl
或
7.1
?
10
6
个精子
/ml(
就这两个有效数值而
言< br>)
。由于计数少于
400
个精子，需要如表
2.2
所示，报告 精子总数为
212
的抽样误
差（大约
7%
）。
注 ：
该实例中精液样本被过度稀释，考虑到在大方格
4
、
5
和
6
中计数少于
200
个精子，
1 + 4 (1: 5)
稀释应该更合适。
例
4
：
1+4 (1:5)
稀 释下，第一次计数时在
4
行内发现有
224
个精子，第二次计
数时在
4
行内发现有
268
个精子，
8
行内精子总计数为
492(224+268)
个，两组差异
41
值是
44(268
–
224)
。
从表
2 .4
中可以看出这个值已经超出了偶然概率所允许的差
异值（
43
），因此需 要重新双份稀释
。
例
5
：
1+4 (1:5)
稀释下，第一次计数时在
8
行内发现有
224
个精子，第二次计数时在
8
行内发现有
213
个精子，总计数是
16
行内 有
437(224+213)
个精子，差异
值是
11(224
–213)
。从表
2.4
中可以看出这个值小于偶然概率所允许的差异值
（
41
），因此计数获得认可。
1+4 (1:5)
稀释下样本的精子浓度为
C
= (
N/n
)
?（
1/4
）个精子
/nl
或
(437/16)/4 =
6.825
个精子
/nl
或
6.8
?
10
6
精子
/ml(
就这两个有效数值而言
)
。
注：
1+4 (1:5)
稀释下精子密度的计算也很简单，
精子的密度值是计 数的精子总数
除以行数再除以
4
。
上面示例中精子密度计算为
((2 24+213)/(8+8))/4 =(437/16)/4 =
27.3/4 = 6.8
?
10
6
/ml
。
2.8.6
参考值下限
精子密度的参考值下限是
15
?
10
6
/ml
(5th
百分位点
, 95%CI 12
～
16
?
10
6
/ml)
。
2.8.7
计算一次射精的精子总数
建议计算和报告每次射精的精子总数，
该参数可评 价睾丸生精功能和输精管
道的通畅情况。该值由精子密度乘以精液量获得。
2.8.8
参考值下限
参考值下限是
39
?
1 0
6
精子
/
每次射精
（
5
th
百分位点
, 95%CI 33
～
46
?
0
6
)
。
2.9
稀少精子：隐匿型精子症和疑似无精子症
如果在重复湿片制备中没有发现精子，可怀疑为无精子症。
虽然有人曾建议
更改其定义
（
Ezeh & Moore, 2001
年
；
Sharif,2000
年）， 但无精子症仍只是作
为精液状态的一种描述，而并非精子发生或诊断及治疗的基础。
然而应牢记的是：
?
在离心管中能否找到精子取决于离心时间、
速度
（
Lindsay et al., 1995; Jaffe et
al., 1998)
和检测的离心样本数量；
?
3000g
离心
15
分钟并不能将样本中的精子全部分离出来；
?
离心后，精子活力将有所丢失
(Mortimer 1994a)
，精子密度将会被低估
42
(Cooper et al., 2006)
。
精液样品的处理方式取决于精子的一般情况和精子活 力（请参阅
2.10
节）
，
或是否要求精确的精子数目。
（请参阅
2.11
节）
。
2.10
当不需要准确计数稀少精子时
初始湿片制备中如果每高倍视野的精子数目稀少
(
即
400
倍数下
0
～
4
个精
子
/HPF
或
200
倍数下
0
～
16
个精子
/HP F)
，可有以下几个选择。
2.10.1
不采取进一步的操作
如果每个?
400
视野的精子数目小于
4
（即密度约小于
1
?
10
6
/ml
），报告精
子密度为
2
?
10
6
/ml
（考虑到与稀少精子相关的高样本误差）及注明是否看到活动精子就已达到临床需求。
2.10.2
精液样本离心后检测精子
如果初始湿片制备中没有发现精子，
则精液样本需要离心后检测以确定精子
是否存在于 更大量的样本中。
?
混匀精液样本（参阅框
2.3< br>）。如果样本粘稠度高，则如章节
2.3.1.1
所描述
操作以降低其粘稠度。
?
取
1ml
精液
3000g
离心
15
分钟。
?
弃掉大部分上清液使子弹头内保留约
50?
l
的精浆。
?
分别从子弹头内吸取
10?
l
精液置于载玻片并覆盖
22mm
?
22mm
的盖玻片。
这样两个池深约为
20?
m
的湿片就制成了
(
参阅
框
2.4)
。
?
在?
200
或?
250
倍数的光学相差显微镜 下检测载玻片。
?
有序的逐个视野扫视整个盖玻片区域。从一个角落开始沿
x
轴扫描到另一
侧，
然后沿
y
轴移动一个视野并以整个视野宽度向回返方向扫视。
以这种
z
形方式继续扫视，确保对整份样本进行完整和系统的检测（请参见图
9
）。
当改变视野时要保持对载玻片的观测。
?
使用?
20
的物镜和孔径为
20 mm
?
10
目镜时，整个显微镜视野的直径大约
1000?
m (
参阅框
2.9)
。因此
22 mm
?
22 mm
盖玻片被检区域大约有
484
个显
微镜视野。
?
在任一载玻片中如发现精子诊断为隐匿型精子症。
43
?
在两个载玻片中均未发现精子诊断为无精子症。
注
1
：
许多使用
15ml
离心管的台式离心机未能达到
3 000g
：建议使用
1.5
–
2.0ml
离
心管的高速离心 机。在取样前确保精液充分混匀。
注
2
：
由于该样本具有较高的干 扰因素，因此扫视整个载玻片将需要
10
分钟的时
间。
注
3
：
当精液离心是用来进行辅助生殖时，
需要对整份精液和更多的子弹头
（如
4
?
10?
l
子弹头）进行分析以找到活精子。
注释
1
：
在检测样本中没有发现活动精子并不代表剩余的精液样本亦是如此。
注释
2
：
由于没有将全部精液离心，
因此这种方法并不能 计数总精子数。
如需要
确定数量，请参阅
2.11.1
节或
2.11.2
节
。
2.10.3
非离心样本检测活动精子
当需要获得活动精子
（例如输精管切除术后的精液 ）
，
必须避免用固定剂稀
释精液或高速离心。这种情形下，只有未稀释的精液样本可以 用来评估。
?
混匀精液样本（参阅
框
2.3
）。
?
吸取
40?
l
精液置于载玻片并覆盖
24mm
?
50mm
的盖玻片。这样池深约为
33?
m
的湿片就制成了
(
参阅
框
2.4)
。
?
在 ?
200
或?
250
倍数的光学相差显微镜下检测载玻片。
?
有序的逐个视野扫视整个盖玻片区域。从一个角落开始沿
x
轴扫描到另一
侧，
然后沿
y
轴移动一个视野并以整个视野宽度向回返方向扫视。
以这种
z
形方式继续扫视，确保对整份样本进行完整和系统的检测（请参见图
9
）。
当改变视野时要保持对载玻片的观测。
?
使用?
20
的物镜和孔径为
20 mm
的?
10
目镜时，整个显微镜视野的直径大约
1000?
m (
参阅
框
2.9)
。因此
24mm
?
50mm
的盖玻片被检区域大约有
1200
个显微镜视野。
注：
由于该样本具有较高的干扰因素，因此这些步骤将需要
10
分钟的时间。
图
2.9
扫视盖玻片区域检测活动精子
?
200
放大倍数下，
24mm
?
50 mm
的盖玻片被检区域大约包含
1200
个高
倍视野，
22 mm
?
22 mm
的盖玻片被检区域大约包含
484
个高倍视野。
44
50mm/1000
?
m
=50
个视野
注：
在检测样本中没有发现活动精子并不代表剩余的精液样本亦是如此。
2.11
当需要准确计数稀少精子时
本节描述采用非离心法计数稀少精子。以低倍稀释精液进行检测，或者加
大测定样本 的体积，两种方法可选择其一。
进行定量分析时，下限值误差不可超过
20%
（
Shah et al.，
2000
）
。当采用改
良纽鲍尔氏计数池的中央大方格
（图< br>2.7
中
5
号位置）
对稀释倍比为
1:2
的精液进行计数时，
理论上可以测定的精液密度为
250 000
条
/ml，
此时的抽样误差即为
20%
。而对所有的
9
个大方格进行检测 时，其测定的最低阈值为
27
800
条
/ml
。
容积为
25
?
l的大容量计数池可测定的精子浓度为
1000
条
/ml
，其抽样误差是相
同的（
Cooper et al.,2006
）
。与本手册推荐使用的稀释 倍比为
1:2
的精液相对应，
上述测定值分别与未稀释精液中的密度
500 000
条
/ml
、
55 600
条
/ml
及
2000
条
/ml
相对应。
但是，
精液稀释倍数越低其背景值也就 越大。
大容量计数池扫视需用时
10
～
20
分钟，荧光染料的使用可 以加快扫视速度（参阅
2.11.2
节）
。
2.11.1
在改良纽鲍尔氏计数池中检测稀少精子（相差显微镜）
为了减少抽样误差，精子计数的数量必须达到一定的标准（最好重复计数
的精子总数至少
400
条且单个计数池大约计数
200
条）
。
（见框
2.7
及表
2.2
）
?
充分混匀精液样本（见框
2.3
）
。
45
24mm/10001000um=24
个
视
野
总共
1200
个视野
?
吸取一定量 的精液和等量的固定液进行
1
：
2
稀释（见
2.7.5
）< br>，注意事项
见章节
2.8.2
。
?
在初 始的湿片制备中，
1
：
2
稀释精液每高倍视野的精子数少于
2
条对精
子浓度的波动是适合的，这样整个计数池的精子为
200
条（表
2. 3
）
。需
要在
1
和
9
号大方格中进行测定。
框
2.11
改良纽鲍尔氏计数池全部
9
个 大方格的计数精子达到
200
条
在初始的湿片制备中，如果容积为
4nl
的每高倍视野检测精子数是
2
，理论
上精子密度则是
0.5< br>条
/nl
（
500
条
/?
l
或者
5 00 000
条
/ml
）
。
改良纽鲍尔氏计数池全部9
个大方格的容积为
900nl
，则其内大概有
450
条
精子。建议将精液按
1:2
稀释，这样将降低干扰，计数池精子数减少到
225条，
以获得足够低的抽样误差。
注：
由于计数的精子数太少且计算的容 积可能不太准确，
因此该值只能是一个粗
略的估算。
2.11.1.1
操作步骤
1
、如上述取等量固定剂按
1+1
（
1 :2
）稀释双份精液样本。
2
、两个细胞计数池各用一份稀释精液予以充池。
3
、
将 血细胞计数板平放置于湿盒内
（例如放在浸透水的过滤纸上并盖上皿）
以免干燥，在室温下储存 至少
4
分钟。这段时间不动的细胞将沉淀在方格内。
4
、在?200
或?
400
放大倍数的光学相差显微镜下检测血细胞计数池。
< br>5
、每次重复计数至少
200
条精子，以获得足够低的抽样误差（见框
2.7
及
表
2.2
）
。
6< br>、对其中一个计数池逐个方格进行检测，直到计够
200
条精子和完整的一
个方 格。需对整个方格进行计数，不可于方格中间停止。
7
、记录精子计数达到
200
条时的方格数量。另一计数池计数精子时也要检
测相同数量的方格。
8
、借助实验室计算器计算精子的数目和方格数。
9
、切换至另一 计数池，重复计数与第一次相同的方格数（相同体积），即
便计数结果少于
200
个精子。
10
、计算两次计数精子的总数及差异值。
46
11
、根据表
2.5
（由表
2.4
扩展至稀少精子）或附录
7
图
A7.1
确定差异的
可接受性
(
两者均显示 在
95%
的可信区间内，单纯抽样误差允许的两个数值的最
大差异值。
)。
12
、如果差异可以接受，则计算精子密度（请参见
2.11.1. 2
）；如果差异太
大，则如上所述重新进行双份稀释并重新计数（请参阅框
2.10
）。
13
、取两个有效数值的平均值作为精子密度予以报告。
14
、计算该次射精的总精子数（见
2.11.1.5
）
。
2.11.1.2
计算稀少精子密度
精液中的精子密度是指精子总数
（
N
）除以计数精子所在的精液体 积，即重
复计数的总方格数
（
n
）
的容积
（单个计数方格相 当于
100nl
）
，
再乘以稀释倍数。
其计算公式为：
C
= (
N
/
n
)
?
(1/100)
?稀释倍数。
1 + 1 (1: 2)
稀释的精液，精子密度为
C=
（
N/ n
）?（
1/100
）?
2/nl
，即
C=
（
N/n
）?（
1/50
）
/nl
。
< br>当计数池的九个大方格都进行检测时，每
?
l
精子密度计算为：精子总数除以两个计数池的总体积（
1.8?
l
）
，然后乘以稀释倍数（
2
）
。
2.11.1.2
计算稀少精子密度
精液中的精子密度是指精子总数
（
N）除以计数精子所在的精液体积，即重
复计数的总方格数
（
n
）
的容积
（单个计数方格相当于
100nl
）
，
再乘以稀释倍数。其计算公式为：
C
= (
N
/
n
)
?
(1/100)
?稀释倍数。
47
表
2.5
两次计数的指定数值所允许的差异值：稀少精子
总数
可接受
差异值
*
总数
可接受
差异值
*
总数
可接受
差异值
*
35-40
41-47
48-54
55-62
63-70
71-79
80-89
90-98
99-109
110-120
121-131
132-143
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
144-156
157-169
170-182
183-196
197-211
212-226
227-242
243-258
259-274
275-292
293-309
310-328
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
329-346
347-366
367-385
386-406
407-426
427-448
449-470
471-492
493-515
516-538
539-562
563-587
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
*
基于
95%
的可信区间
1 + 1 (1: 2)
稀释的精液，精子密度为
C=
（< br>N/n
）?（
1/100
）?
2/nl
，即
C=
（
N/n
）?（
1/50
）
/nl
。
< br>当计数池的九个大方格都进行检测时，每
?
l
精子密度计算为：精子总数除以两个计数池的总体积（
1.8?
l
）
，然后乘以稀释倍数（
2
）
。
2.11.1.3
方法的敏感性
如果每个计数池的精子数量少于
200
条，其抽样误差将超过
5%
。当两 个计
数池的精子总数少于
400
时，则需报告精子计数的抽样误差（见表
2. 2
）
。
如果每个计数池的精子数量少于
25
个，
则该精液标本的密度低于
56 000
个
/ml
；这是在
1:2样本稀释下对改良纽鲍尔氏计数池全部九个大方格计数时，抽
样误差为
20%
的下 限值（
Cooper et al.
，
2006
）
。检测报告应该给出计数的精子总
48
数并标明“精子数量太少（
<56 000/ml
）以致无法进行准确定量”。
注释：
在检测样本中没有发现精子并不代表剩余的精液样本亦是如此。
2.11.1.4
示例
例
1
：
1+1
（
1:2
）稀释下，第一次重复计数时
2
个方格的精子总数为
200
，第
二次重复计数时
2
个方格的精子总数为
250
，
4
个方格的计数精子总量为
450
（
200+250
）
， 两次计数的差异值为
50
（
250-200
）
。从表
2.5
可以看出这个值已经
超出了偶然概率所允许的差异值（
42
），因此需要重新 双份稀释
。
例
2
：
1+1
（
1:2
）稀释下，第一次重复计数时
3
个方格的精子数量为
210
，
第二次重复计数时
3
个方格的精子数量为
200
，
6
个方格的精子总数为
410
（
210+200
）
，两次计数的差异 值为
10
（
210-200
）
。从表
2.5
可以看 出差异值小于
偶然概率所允许的差异值（
40
），因此计数获得认可。
1+1
（
1:2
）稀释下样本的精子密度为
C=
（
N/ n
）?（
1/50
）
/nl
，即（
410/6
）< br>/50=1.37/nl
，或
1.4 ×
10
6
/ml
（就这两个有效数值而言）
。
例
3：
1+1
（
1:2
）
稀释下，
第一次重复计数时全部< br>9
个方格的精子数量是
120
，
而第二次重复计数时全部
9< br>个方格的精子数量是
140
，
18
个方格中的精子总数为
26 0
（
120+140
）
，两次计数的差异值为
20 (140-12 0)
。从表
2.5
可以看出差异值小
于偶然概率所允许的差异值（
3 2
），因此计数获得认可。
当计数池的九个大方格（
1.8
?< br>l)
都进行检测时，
1+1
（
1:2
）稀释下样本的精子密度为
C=(N/1.8) ×
2 /?
l = (260/1.8) ×
2 = 288.8 /?
l,
或
290 ×
10
3
/ml
（就这两个有
效数值而言）
。由于计数精子总数少于400
，需如表
2.2
所示报告精子总数为
260
的抽样误差（ 大约
6%
）
。
例
4
：
1+1
（
1:2
）
稀释下，
第一次重复计数时全部
9
个方格的精子数 量是
10
，
而第二次重复计数时
9
个方格的精子数量是
8< br>。
因为计数精子总数少于
25
，
因此
精子密度
<56
000/ml
；检测报告为“检测精液样本中可见
18
条精子，因精子数
太少而无法准确定量（
<56 000/ml
）
”
。
例
5
：
1+1（
1:2
）稀释下，两个计数池中均未发现精子。因为精子总数少于
25
条，因此精子密度
<56 000/ml
；检测报告为“检测样本中无精子存在，因精子
量太少而无法准确定量（
<56 000/ml
）
”
。
49
2.11.1.5
计算一次射精的精子总数
建议计算和报告每次射精的精子总数，
该参数可评价睾丸的生精功能和输精
管道的通畅 情况。该值由精子密度乘以精液量获得。
2.11.2
一次性大容量计数板检测稀少精子（荧光显微镜）
使用大容量、池深为
10 0?
m
的计数板可增加精子密度检测的敏感性。大容
量计数板含有两个池深为
100?
m
的计数池，每个的容积为
25?
l
。为了减少抽样
误差，精子计数的数量必须达到一定的标准（最好重复计数的精子总数至少
400
条且单个计 数池大约计数
200
条）
。
（见框
2.7
及表
2.2
）
?
充分混匀精液（见框
2.3
）
。
?
使用含有
Hoechst
33342
双苯甲亚胺荧光素
(1 毫克
/
升
)
的固定剂
(
参见
2.7.5)将精液进行
1+1
（
1:2
）稀释。注意事项见
2.8.2。
在初始的湿片制备中，
1+1(1:2)
稀释精液每高倍视野的精子 数少于
2
条对精
子浓度的波动是适合的，这样整个计数池的精子为
200条（见框
2.12
）
。
框
2.12
一次性大容量计数板的计数精子达到
200
条
在初始的湿片制备中，如果容积为
4nl
的每高倍视野仅检测到
1
条 ，则理论
上精子密度是
0.25/nl
（
250/?
l
或者
250 000/ml
）
。
一次性大容量计数板的容积为
25?
l
，
则其内大概有
6250
条精子。
建议将精液按
1+1
（
1:2
）稀释，这样将降低干扰，计数池精子数减少到3125
条，以获得
足够低的抽样误差。
注：
由于计数的精子 数太少且计算的容积可能不太准确，
因此该值只能是一个粗
略的估算。
2.11.2.1
操作步骤
1
、如上述取等量固定剂按
1+1
（
1:2
）稀释双份精液样本。
2
、两个计数池各用一份
25?
l
稀释精液予以充池。
< br>3
、将计数板平放置于湿盒内（例如放在浸透水的过滤纸上并盖上皿）以免
干燥，在暗室 内室温下储存至少
10-15
分钟。这段时间染料将结合至精子头部，
不动的细胞将沉 淀于池底。
4
、
使用带有分色镜和滤光器的荧光显微镜在?
250
放大倍数下检测计数池。
50
嚼槟榔头晕-乳腺增生的治疗方法
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