两性教育细菌的生理生化鉴定方法

2021年1月30日发(作者：金刚藤胶囊的作用)































方

2.3.5

细菌的生理生化鉴定

１、形态学观察


法

采用插片法、埋片法
,
对该拮抗细菌的菌落形态特征作镜检观察。用革兰氏
染色进行油镜观察。

①

革兰氏染色

溶液和试剂：革兰氏染液，草酸铵结晶紫染液，卢 戈式碘液，
95%
乙醇，番
红复染液等。

试验步骤：
(1)
涂片：取活跃生长期菌种按常规方法涂片（不易过厚）、干
燥和固定。

(2)
初染：滴加草酸铵结晶紫染液覆盖涂菌部位
1
～２
min< br>，用水冲洗至流出
水无色。

(3)
媒染：先用卢戈氏碘液冲去残留 水迹，再用碘液覆盖１
min
，倾去碘液，
水洗至流出水无色。

(4)
脱色：在上述涂片上流加
95%
乙醇溶液（一般
20
～
30s
），当脱色至流出
液无色时立即用水洗去乙醇。



(5)
复染：将玻片上残留水用吸水纸吸去，用番红复染液染色
2min
，水洗，
用吸水纸吸去残水晾干。



(6)
镜检：用油镜观察。

②

芽孢染色





(1)
制片：按常规方法涂片、干燥及固定。





(2)
加热染色：
向载玻片滴加数滴
5%
孔雀绿水溶液覆盖涂菌部位，
用夹子夹
住载玻片在微火上加热至染液冒蒸汽并维持５< br>min
，加热时应注意补充染液，切
勿让涂片干涸。

脱色：待玻片冷却后，用缓流自来水冲洗至流出水无色。



(3)
复染：用
0.5%
番红水溶液复染
2min
。



(4)
水洗：用缓流自来水冲洗至无色。



(5)
镜检：晾干载玻片后油镜镜检。



③

鞭毛染色（硝酸银染色法）



(1)
载玻片准备：将载玻片置于含洗衣粉或洗涤剂的水中煮沸

20min
，然后
用清水充分洗净，再置于

95%
乙醇中浸泡，使用时取出在火焰上烧去乙醇及可
能残留的油迹。



(2)
菌液制备：
用接种环挑取菌落边缘菌体，
悬浮 于
1
～
2mL
无菌水中制成菌
悬液，不能剧烈震荡。



(3)
制片：
取一滴菌悬液滴到载玻片一侧，
倾斜玻 片，
使菌悬液流向另一边，
用吸水纸吸取多余的菌悬液，自然干燥。



(4)
染色：滴加硝酸银染色
A
液覆盖
3
～< br>5min
，用蒸馏水充分洗去
A
液，再滴
加
B
液染色 约
1 min
，期间可用微火加热，当涂面出现明显褐色时，立即用蒸馏水
冲洗。自然 干燥后用油镜观察。菌体呈深褐色，鞭毛显褐色。



(5)
镜检：用油镜镜检观察。

A
、

B
液需现用现配 （
4h
内效果最佳，
1d
内可用）
：

A
：
单宁酸
5
ｇ，
三氯化铁
1.5
ｇ，
蒸馏水
100mL
，
加
1%
氢氧化钠
1mL
，
15%< br>甲醛
2mL
。

B
：硝酸银粉末
2
ｇ，水< br>100mL
，溶解匀均，取出
10mL
回滴用，往
90mL
溶 液中加浓氨水到出现大量沉淀时再加浓氨水至溶液澄清。
加
10mL
回滴液回滴
至出现薄雾。

２、糖类分解试验



配方：蛋白胨

1.0
ｇ；
NaCl 0.5
ｇ；
0.2%
溴百里香酚兰

1.2mL
；葡萄糖

1.0
ｇ；蒸馏水

100mL
。



基本原理：
糖类分解实验是常 用的鉴别微生物的生化反应，
鉴定细菌能否利
用分解某种糖产生有机酸（如乳酸、醋酸、丙酸等 ）和气体（如氨气、甲烷、二
氧化碳等）
。当发酵产酸是，指示剂可有紫色（
pH6. 8
）转变为黄色（
pH5.2
）
。气
体的产生可由倒置的小管中有无 气泡来证明。



试验步骤：
用记号笔在试管外面分别标明发酵培 养基名称和所接种的细菌的
编号。
取盛有葡萄糖发酵培养基的试管，
按编号接种细菌，
每种细菌做两个平行，
可留一个空白，作为对照。在接种后要轻摇试管，防止倒置的小试管进入 气泡。
再将将上述已接种的和对照管置
37
℃温室中培养
2
～
3d
。
观察颜色变化及小试管
中有无气泡。

３、
V-P
试验



配方：蛋白胨

1.5g
；葡萄糖

1.5g
；
K
2
HPO
4
1.5g
；蒸 馏水
300mL
；
pH
：
7.4





基本原理：
此实验也是常用的检验细菌的生化反应之一。
某些细 菌能分解葡
萄糖产生丙酮酸，
丙酮酸再缩合，
脱羧成乙酰甲基甲醇，
后者在强 碱环境再被空
气中的氧氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白胨中精氨酸的胍基生成红色化合物，称
V- P
反应。



试验步骤：
将被检菌接种于试验培养基中，
培养
2
～
7d
后，
于培养物中加入
1mL 10
％

的
NaOH
，混匀，再加入
3
～
4
滴
2%
氯化铁溶液。数小时后，培养基
表面的下层出现红色者，为阳性。

４、甲基红试验



配方：与
V-P
试验的配方相同



基本原理：
某些细菌在糖代谢过程中，
会分解葡萄糖产生丙酮酸，
丙酮酸还
可进一步分解 ，产生甲酸、乙酸、乳酸等，使培养基
pH
将至
4.5
以下，当加入
甲基红试剂则呈红色，
为甲基红试验阳性。
若细菌分解葡萄糖产酸量小，
或者产
生的酸进一步转化为其它物质（如醇、酮、醚、气体和水等）
，则培养基的酸度
仍会在
pH6.2
以上，故加入甲基红指示剂呈黄色，为阴性。




试验步骤：接种细菌于培养基，在
37
℃培养
2
～
7d后，于培养物中加入几
滴甲基红酒精溶液
（
0.1
ｇ甲基经溶于
300mL 95%
乙醇中，
加蒸馏水至
500 mL
）
，
如呈红色，表示阳性。

５、柠檬酸盐利用试验



配方：柠檬酸钠
1
ｇ；硫酸镁

0.2
ｇ；
NaCl 5
ｇ；
NH
4
H
2
PO
4


1
ｇ；
K
2
HPO
4

1
ｇ；琼脂

20
ｇ；
1
％溴麝香草酚蓝酒精溶液

10mL
；蒸馏水

1000mL
。



基本原理：
柠檬酸盐试验是用来检测柠檬酸盐能否被利用。
细菌在分解柠檬
酸 盐及培养基中的磷酸铵后，
产生碱性化合物，
是培养基的
pH
升高，
当加入
1%
溴麝香草酚蓝指示剂时，
培养基就会有绿色转变为深蓝色。
溴麝香 草酚蓝的指示
范围为：
pH
小于
6.0
时呈黄色，
pH在
6.5
～
7.0
时为绿色，
pH
大于
7.6
时呈蓝色。

试验步骤：
将被检菌接种到
Simmons
固 体柠檬酸盐培养基上，
37
℃下培养
2
～
4d
，
能 利用柠檬酸盐的细菌表现为有细菌生长，
培养基变为蓝色，
不能利用柠檬酸盐
的细菌不 生长，培养基不变色。