宫颈糜烂治疗免疫组化入门实验操作

2021年1月30日发(作者：贫血食疗)

免疫组化实验操作介绍

一、实验目的：

1.

了解免疫组化基本原理。

2.

了解免疫组化实验操作及注意事项。

3.

免疫组化结果判定。

通过实验，让学生熟悉免疫组化操作流程及注意事项，对抗原抗 体结合、
抗原修复和酶催化底物显色进行研究。
要求学生通过查阅文献，
在归纳、对比、
总结的基础上对免疫组化有进一步的了解。

二、实验原理：



三、实验材料：

一抗：
CD5
、
CK8
、
Ki67
二抗：

MaxVision3
其它：柠檬酸抗原修复液、过氧化物酶阻断 剂、
PBS
缓冲液、
DAB
、孵育盒、
染色架、苏木素、盖玻片、冲 洗瓶、中性树胶，孵育盒。

四、实验步骤：


1.

脱蜡水化





二甲苯
5min，
二甲苯
5min
，
二甲苯
5min
，
无水乙 醇
2min
，
无水乙醇
2min
，
95%
酒精2min
，
85%
酒精
2min
，自来水冲洗。

2.

抗原修复

高压锅中加入
1200mL
柠檬 酸修复液，
电磁炉煮沸后放入切片，
扣紧锅盖，
功率调至
800W
， 至压力阀均匀喷气后计时
1.5min
，移开高压锅室温冷却
10min
，自 来水冷却。

3.

过氧化物酶阻断

修复结束后，流水冲 洗干净，除去自来水，在离组织
3mm
处用免疫组化
油笔画圈或用纸巾擦干组织外残留 的液体，滴加
50
μ
L
（一滴）

过氧化物酶
阻 断剂，室温孵育
10min
，
PBS
冲洗
3
×
3m in
。

4.

一抗

甩去
PBS
，纸巾擦干组织
3mm
外的残留液体，每张切片加
50
μ
L（一滴）
相应一抗，室温下孵育
60
分钟，
PBS
冲洗
3
×
3min
。

5.

二抗

甩去
PBS
，纸巾擦干组织
3mm
外的残留液体，每张切片加
50
μ
L
（一滴）
MaxVisionTM
试剂，室温下孵育
3 0
分钟，
PBS
冲洗
3
×
3min
。

6.

DAB
甩去
PBS
液，纸巾擦干组织
3m m
外的残留液体，每张切片加
50
μ
L
（一
滴）新鲜配制 的
DAB
，显色
5
分钟，自来水冲洗。

7.

苏木素复染

每张切片滴加
50
μ
L
（一滴）苏 木素，
20-30
秒后自来水冲洗
30s
以上，
或浸泡于
P BS
中
30s
以上再自来水冲洗。

8.

封片

梯度酒精脱水干燥（
85%
酒精
2min
，
95%
酒精
2min
，无水乙醇
2min
，无
水乙 醇
2min
，二甲苯
1min
）
，或直接电吹风吹干，中性树胶封固 。


修复方法

一、

柠檬酸缓冲液高温高压修复法

取一定量
pH=6.0
柠檬酸盐缓冲 液（
800-1500ml
）于压力锅中，大火加热
至沸腾；
将脱蜡水化后的 组织切片至于不锈钢或耐高温塑料切片架上，
放入已
沸腾的缓冲液中。
盖上锅盖，扣上压力阀，
将功率调至
800W,
继续加热至喷气，
从喷气开始计时，
1.5
分钟后，
压力锅离开热源，
室温冷却
10
分钟后用自 来水
冲淋高压锅外壁加速冷却至室温，取出玻片，自来水冲洗干净。

注意事项：

1
、加热时间长短（
1.5
分钟）和加热功率 （
800W
）的控制很重要，时间过短
可能会使染色强度变浅，时间过长可能会使染色 背景加深。

2
、必须使用不锈钢或耐高温塑料切片架，不能使用铜架，以防缓冲液< br>pH
值
增高而导致掉片。

3
、高压锅离开热源后必须等缓冲液冷却后，才能把切片取出。

4
、为防止组织脱落，必须使用防脱玻片。

5
、缓冲液的量必须保证所有切片都能浸泡到。

二、

EDTA
水煮修复法




取
500m lEDTA
抗原修复液于
1000ml
不锈钢锅中，加热至沸腾，将电磁炉
功 率调至保温状态
（
120W
）
，
使修复液保持微沸状态。
将 脱蜡水化后的切片置
于耐高温染色架上，
再将染色架缓慢放入不锈钢锅中
（注意：若快速放入可能
会导致组织脱落）
，
之后加盖继续加热
20
分钟 。
再将不锈钢锅从电磁炉上移开，
室温冷却
10
分钟后用自来水冲淋不锈钢锅 外壁加速冷却至室温，取出玻片，
自来水冲洗干净，除去自来水，在离组织
3mm
处用 免疫组化油笔画圈，
PBS
冲洗
2
次，每次
3
分钟。


注意事项：

1
、加热时间长短（
20
分钟 ）和加热功率（
120W
）的控制很重要

2
、修复液不能重复使用。

3
、工作液的量必须保证切片始终能浸泡在液体内。

4
、为防止组织脱落，必须使用防脱玻片。

5
、抗原修复后一定要等修复液冷却后，才能将切片取出。



石蜡切片制作和
HE
染色

一、目的要求：
简要介绍石蜡切片的制作和苏木精、

曙红染色法（简称
H.E
染色法），

借以了解石蜡切片制作的基本原理和一般方法。

二、实验用具：
解剖器一套 、单面刀片、切片刀、切片机、载玻片、盖玻片、
标本瓶、烧杯、量筒、漏斗、染色缸、树胶瓶、酒精灯 、毛笔、绘图纸、滤纸、
熔蜡箱（或恒温箱）、展片台（或烫板）、小木块、蜡带盒、烤片盒、切片托< br>盘。

三、实验材料：
蛙或小白鼠。

四、实验内容：


（一）药品：

１、７０％、８０％、９０％、９５％酒精及无水酒精：





９５％以下的各级浓度酒精是用９５％酒精加蒸馏水稀释而成。
简单的稀
释 方法：
所需稀释的浓度是多少，
就量取多少毫升原浓度的酒精，
再加蒸馏水
至 该酒精的原浓度即可。例如，配制７０％酒精，就量取７０
ml
９５％酒精，
然后加入 ２５
ml
蒸馏水即成。

２、固定液：