尖锐湿疣中药泡菜中有害微生物和亚硝酸盐含量的测定

2021年1月30日发(作者：白马寺远红外消痛贴)

泡菜中有害微生物和亚硝酸盐含量的测定


生物科学系



【摘要】
采用平板菌落计数法和多管发酵法分别测定了市面上的
7
种和家庭中自制的
5
种常见
泡菜中的细菌总数和总大肠菌群，
并与 国家腌制蔬菜食品安全标准作对比。
实验结果表明：
在
所检测的
6
种 农贸市场上常见的、
2
种正规超市所购买的和
4
种家庭自制泡菜中，有
3
种泡菜
的细菌总数超标，
有
1
种泡菜的大肠菌群均超标。
所有的泡菜样品中，
亚硝酸盐含量均低于国
家卫生安全标准无超标现象。

【关键词】
泡菜；大肠菌群；细菌总数；亚硝酸盐

泡菜是指能使蔬菜长时间 贮藏的一种加工方式，
在我国有着悠久的历史。
其
加工方式与设备简单易行，
所用原料也很广泛，
一般富含纤维素的蔬菜或者水果，
都可以被腌制成泡菜，常见的泡菜有泡萝 卜、泡大白菜、泡黄瓜、泡藠头等等。
泡菜具有助消化、
调节脾胃、
消脂解腻等作用。
另外泡菜中含有含量丰富的维生
素、
磷和钙等元素，
能为人体补充其所需要的 元素，
同时又能有效地预防动脉硬
化等的疾病，故深受现代人们的喜爱
【
1< br>】

。

但是，
泡菜在制作和发酵的过程中易被细菌污染。< br>细菌在泡菜中常见致病微
生物有：
大肠杆菌、
沙门氏菌、
青霉菌、志贺氏菌、
乳酸杆菌、
金黄色葡萄球菌、
炭疽杆菌等
[2]
。其 中大肠杆菌是一类革兰氏阴性菌，是人和动物肠道内的正常菌
群，
一般不会致病，
并且 在肠道中能合成维生素
K
和
B
组维生素而被动物利用。
但如果大肠杆 菌侵入到宿主免疫力低下的外组织和器官时，将会引起肠外感染。
且有少数菌株可直接引起肠道感染，< br>这些大肠杆菌就称为致病性大肠杆菌。
致病
性大肠杆菌现已发现
4
种。
即①肠侵袭性大肠杆菌，
肠侵袭性大肠杆菌是国际公
认的食物中毒病原菌，
主 要黏附结肠黏膜上皮细胞并在此生长繁殖，
死亡后产生
内毒素，
引起肠黏膜细胞的炎性 反应和溃疡，
出现血性腹泻。
②肠产毒性大肠杆
菌，
肠产毒性大肠杆菌主要在 小肠内繁殖，
致病物质是不耐热肠毒素和耐热肠毒
素两种毒素，
这两种毒素可引起腹泻 。
③肠出血性大肠杆菌，
肠出血性大肠杆菌，
可产生志贺样毒素，
可导致出血 性结肠炎、
严重腹泻和便血。
④肠致病性大肠杆
菌，
肠致病性大肠杆菌在十二 指肠、
空肠和回肠上段大量繁殖，
一般不产生肠毒
素，
可引起水样腹泻，粪便中带有黏液
【
3
］
。
次实验旨在检测几种常见的泡菜中的< br>细菌总数以及大肠杆菌群的数量，
并与国家腌制蔬菜食品安全标准作对比。
作为
各位消费者在今后购买或制作泡菜的卫生标准提供一个较为标准的参考依据。

其次，
泡菜在发酵过程中，
由于部分有害微生物和硝酸还原酶的作用，
会将
硝酸盐转化为亚硝 酸盐，
亚硝酸盐是一种致癌物，
摄入过量将会对人体造成危害，
会引起人体高铁血红蛋 白症，
从而导致组织缺氧，
同时使血管扩张、
血压降低等。
例如白菜、
萝卜等蔬菜中含有一定数量的硝酸盐。
如果腌菜时气温太高，
放盐不
足
12 %
，腌制的时间不足
10
天，就会使硝酸盐还原成有毒的亚硝酸盐。所以，
适 当吃点腌菜虽可以调节胃口，增加食欲，但若嗜食腌菜成癖，是不可取的，如
果长期食用，就会引起各种 疾病。

为此，泡菜中的亚硝酸盐含量的测定是食品
卫生安全检验的必测项目之一[4]
。我国《食品卫生标准》
GB 15198
—
4
规定，酱
腌菜中亚硝酸盐（以亚硝酸钠计）允许量≤
20mg/kg
，该方法亚硝酸盐检出量限
为
1mg/kg
[5]
。

1
实验材料

1.1
样品采集

市面上的
6
种散装泡菜
（泡萝卜 、
泡黄瓜、
跑豇豆、
泡大蒜头、
泡藠头、
泡生姜）
，分别编 号为
1
，
2
，
3
，
4
，
5
，
6
。超市袋装泡菜两种（泡小米辣、
泡韭菜花）分别编号为
7
，
8
。家庭自制泡菜
4
种（泡卷心菜、泡芹菜、泡
大白菜、泡莴笋）< br>，分别编号为
9
，
10
，
11
，
12
。分别用灭过菌的塑料袋子
密封装好，立即带回实验室进行检测试验。

1.2
仪器与试剂


仪器

光学显微镜（
NO
：
0601136
）
、恒温培养箱（
LRH-301-GS< br>）
、冰箱（海尔）
、
无菌操作台（型号：
ZHJH-11ZC
）
、
G-101
电热鼓风干燥箱（上海比朗一起有限
公司）
、
G204
分析天平（上海方瑞仪器厂）
、
WHS-24
恒温水浴箱、
721
型分光光
度计（符合
GB 9721
要求）等。

试剂

①

pH9.6
—
9.7
的
NH
4
CL
缓冲溶液

1L
容量瓶中加入
500mL
水，
准确加入
20.00ml
HCL
，震荡混匀，准确加入
50.00 mL
氢氧化铵，用水稀释至刻度
【
5
】
。


②

0.42mol/L
硫酸锌溶液

称取
12g ZnSO
4
.
7H
2
O
，用水稀释定容至
100 mL
【
5
】
。

③

2% NaOH
溶液

称取
2gNaOH
，用水定容至
100mL
【
5
】
。

④

对氨基苯磺酸溶液

称取
0.1g
盐酸萘乙二胺，加入
60 %
乙酸并稀释溶解至
100mL
，溶于
70mL
水和
30m L
冰醋酸中，置棕色瓶混匀，室温保存
【
5
】
。

⑤

0.1%
盐酸萘乙二胺溶液

称取
0.1 g
盐酸萘乙二胺，加入
60%
乙酸溶解并稀
释到
100mL
，混匀后贮藏于棕色瓶中，保存于冰箱中，一周内可用
【
5
】
。

【
5
】
⑥

显色剂

将
0.1%
盐酸萘乙二胺和对氨基苯磺酸溶液等体积混合
（现配现用）
。

⑦

亚硝酸钠标准贮备液

准确称取
0.2500g
于硅胶干燥器中干燥
24h
的
NaNO
2
，
用水溶解，移 至
500mL
容量瓶中，加入
100mL
NH
4
CL缓冲溶液，定容至刻度，
至棕色瓶中保存。此溶液每毫升含
5.0ugNaNO
2
【
5
】
。

⑧

60%
乙酸溶液


量取
60mL
冰醋酸于
100mL
容量瓶中，
用水定容至刻度
【
5
】
。

1.3
培养基

牛肉膏蛋白胨培养基，水
1000ml
、牛肉膏

5.0g
、蛋白胨

10.0g
、
Nacl 5.0g
、
琼脂

20.0g,PH
调至
7.0-- 7.2
。高压蒸汽灭菌
121
℃灭菌
20
分钟。

伊红美蓝培养液，
水

1000ml
、
乳糖

10.0g
、
蛋白胨

10.0g
、
磷酸氢二钾

2.0g
、
2%
伊红水溶液

2ml
、
0.5%
美蓝水溶液

1ml, PH
调至
7.2--7.4
。
高压蒸汽灭菌
115
℃
灭菌
20
分钟。

伊红美蓝琼脂培养基，水

1000ml
、伊红美蓝琼脂

45.0g, PH
调至
7.2-- 7.4
，
压蒸汽灭菌
115
℃灭菌
20
分钟。

2
原理

2.1
细菌总数测定原理

用营养琼脂倾 注平板，
测定被检物在单位重量或体积
（
g
或
ml
）
内所含
有的活细菌数量，以判明被检物被细菌污染的程度
2.2
大肠杆菌鉴定原理< br>
大肠菌群：一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧盒兼性厌氧的革兰氏阴性
无芽孢杆菌。该 菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食
品的卫生质量，推断食品中有否染肠道致病菌 的可能
【
7
】
。

大肠菌群系以
100mL
（
g
）检样内大肠菌群最可能数（
MPN)
表示
【
7】
。

【
6
】
。

2.3
亚硝酸盐测定

在弱酸性介质中，
亚硝酸盐与对氨基苯磺酸发 生重氮反应，
生成的重氮化合
物，
再与盐酸萘乙二胺偶联成紫红色的偶氮染料，
在
540nm
处测定其吸光度，
根
据标准曲线计算亚硝酸盐含量
【
8
】
。

W(NaNO
2
) =
m
*
1000

M
*
V
1
/< br>V
*
1000
式中
:W(NaNO
2
)
—

咸菜中硝酸盐的含量
(mg/ kg)
；

M
—

样品的质量
(g)
m
—

标准曲线计算样品中亚硝酸盐的质量
(
μ
g)
；

V
—

处理样品定容的总体积（
mL
）
；

V
1

—测样体积（
mL
）

3
实验方法

3.1
细菌总数的测定



3.1.1
样品预处理及培养

利用泡菜汤进行细菌总数的测定。以无菌操作 取泡菜汤
1ml
加入盛有
9ml
、
0.9%
无菌生理盐水的 试管中充分混匀，即为
10
-1
稀释液。然后再取
10
-1
稀释液
1ml
加入盛有
9ml
、
0.9%
无菌生理盐水的试 管中充分混匀，即为
10
-2
稀释液。以
此类推制成
10
- 1
、
10
-2
、
10
-3
3
个不同稀释 倍数的水样。每一稀释度各取
1ml
加入
灭菌培养皿中
,
每个稀释度 做
3
个重复。
分别倾入约
20ml
已溶化并冷却至
47℃左
右的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，
立即摇匀平皿，
使泡菜汤样品样与培养基充分 混
匀。
[9]
待培养基充分凝固后，倒置于培养箱中
37
℃培养24h
。



3.1.2
菌落形态学的鉴定

细菌在合适的培养基内部或表面生长形成菌落。
利用菌落的形态学特征可以
鉴定一些菌 种。菌落的形态学特征包括菌落形状、大小、高度、质地、边缘、颜
色、表面状态、透明程度、密度、硬 度等
[10]
。菌落形态学一般在培养
24
～
48
h
内用肉眼观测，不同菌群培养基菌落形态学特征不同。


3.1.3
数据统计

微生物数量级的计算方法为：
①先计算相同 稀释度的平均菌落数，
若其中一
个平板有较多菌落连在一起成片时，
则应不采用，而应以不成片的菌落平板作为
该稀释度的菌落数。
若成片菌落的大小不到平板的一半，而其余的一半菌落分布
又很均匀时，
则可将此一半的菌落数乘
2
以代表全 平板的菌落数，
然后再计算该
稀释度的平均菌落数。
②首先选择平均菌落数在
30
～
300
之间的，
当只有一个稀
释度的平均菌落数符合此范围时 ，
则以该平均菌落数乘其稀释倍数即为该泡菜汤
样品的细菌总数。
③若有两个稀释度的 平均菌落数均在
30
～
300
之间，
则按两者
菌落总数之比 值来决定。若其比值小于
2
，应采取两者的平均数
;
若大于
2
，则取
其中较小的菌落总数。④若所有稀释度的平均菌落数均大于
30
，则应按稀释 度
最高的平均菌落数乘以稀释倍数。⑤若所有稀释度的平均菌落数均小于
300
，则< br>应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数。
⑥若所有稀释度均无菌落生长，
则
以小于
1
乘以最低稀释倍数。
⑦若所有稀释度的平均菌落数均不在
30
～
300
之间，
则以最近
30
或
300
的平均菌 落数乘以稀释倍数。⑧若所有稀释度的菌落数均不
可计数，则以最高稀释倍数无法计数报告之
[ 11]
。

3.2
大肠菌群的测定

3.2.1
初发酵试验

分别在
2
个含有
50ml
伊红美蓝培养液的三角烧瓶中各加入每种
100ml
泡菜
汤样品。在
10
支装有
5ml
伊红美蓝培养液的试管中，各加入
10ml
泡菜汤 样品。
混匀后，
37
℃培养
24h
，
24h
未变色 的继续培养至
48h
【
12
】
。

3.2.2
平板分离

将
24h
培养后变色和
48 h
培养后变色的发酵管，
分别划线接种于伊红美蓝琼
脂平板上，
再于
37
℃下培养
18
～
24h
，
将符合下列特征菌落：
深紫黑色有金属光
泽；紫黑色，不带或略带金属光泽；淡紫红色中心颜色较深，其中的一小部分，进行涂片，革兰氏染色，镜检
【
12
】
。

3.3.3
复发酵试验

经涂片、染色、镜检，如果是革兰氏阴性无芽胞杆菌 ，则挑取该菌落的另一
部分，
重新接种于伊红美蓝培养液中，
每管可接种来自同一初发 酵管的同类型菌
落
1
～
3
个，
37
℃培养
24h
，实验结果若有金属光泽，即证实有大肠杆菌群存在。
证实有大肠杆菌群存在后，再根据 复发酵试管的阳性管数查表（附录
1
）
，即得
总大肠菌群
【
12
】
。

3.3
亚硝酸盐含量的测定