长庚医院预约挂号-叶芃
一、写出你拟研发的基因工程药物的
cDNA
序列和蛋白质序列（可自由选择有应用价值的靶标基因）。
研发的基因工程药物名称：重组人
GCSF
（
CSF3
）
cDNA
序列：
1 atggctggac ctgccaccca gagccccatg aagctgatgg ccctgcagct gctgctgtgg
61 cacagtgcac tctggacagt gcaggaagcc acccccctgg gccctgccag ctccctgccc
121 cagagcttcc tgctcaagtg cttagagcaa gtgaggaaga tccagggcga tggcgcagcg
181 ctccaggaga agctgtgtgc cacctacaag ctgtgccacc ccgaggagct ggtgctgctc
241 ggacactctc tgggcatccc ctgggctccc ctgagcagct gccccagcca ggccctgcag
301 ctggcaggct gcttgagcca actccatagc ggccttttcc tctaccaggg gctcctgcag
361 gccctggaag ggatctcccc cgagttgggt cccaccttgg acacactgca gctggacgtc
421 gccgactttg ccaccaccat ctggcagcag atggaagaac tgggaatggc ccctgccctg
481 cagcccaccc agggtgccat gccggccttc gcctctgctt tccagcgccg ggcaggaggg
541 gtcctagttg cctcccatct gcagagcttc ctggaggtgt cgtaccgcgt tctacgccac
601 cttgcccagc cc
蛋白质序列：
1 magpatqspm klmalqlllw hsalwtvqea tplgpasslp qsfllkcleq vrkiqgdgaa
61 lqeklcatyk lchpeelvll ghslgipwap lsscpsqalq lagclsqlhs glflyqgllq
121 alegispelg ptldtlqldv adfattiwqq meelgmapal qptqgampaf asafqrragg
181 vlvashlqsf levsyrvlrh laqp
二、分析该
cDNA
序列的限制性内切酶位点。
Name:
GCSF
Conformation:
linear
Overhang:
five_prime, three_prime, blunt
Minimum Site Length:
5 bases
Maximum Number of Cuts:
1
Included:
all commercial, prototypes only
Noncutters:
AarI, AbsI, AccI, AclI, AflII, AflIII, AgeI, AgsI, AjuI, AlfI, AloI, ApoI, ArsI,
AscI, AsuII, AvrII, BaeI, BalI, BamHI, BarI, BbvCI, BcgI, BciVI, BclI, BdaI, BglII, BplI,
BsaAI, BsaBI, BsePI, BsmI, BsmAI, Bsp1407I, BspHI, BsrBI, BsrDI, BstEII, BtrI, CfrI,
ClaI, CspCI, DraIII, DrdI, Eam1105I, EciI, Eco31I, Eco57I, EcoRI, EcoRV, Esp3I,
FalI, FauI, FseI, FspAI, HaeIV, HgaI, Hin4I, HindII, HindIII, HpaI, HphI, KpnI,
MauBI, MfeI, MluI, MmeI, MslI, NarI, NcoI, NdeI, NheI, NmeAIII, NotI, NruI, NspI,
OliI, PacI, PleI, PmaCI, PmeI, PpiI, PshAI, PsiI, PI-PspI, PspXI, PsrI, PvuI, RsrII, SacI,
SacII, SalI, SapI, ScaI, PI-SceI, SexAI, SfiI, SgfI, SgrAI, SgrDI, SmaI, SnaBI, SpeI, SphI,
SrfI, SspI, StuI, SwaI, TaqII, TatI, TfiI, TsoI, Tsp45I, TspGWI, Tth111I, VspI, XbaI,
XhoI, XmnI
Name
Eco47III
NaeI
AcyI
ApaLI
Bpu10I
Sequence
AGCGCT
GCCGGC
GRCGYC
GTGCAC
CCTNAGC
Site
Length
6
6
6
6
6
Overhang
blunt
blunt
five_prime
five_prime
five_prime
Frequency
1
1
1
1
1
Cut Positions
179
503
416
65
271
Name
BspMI
BtgZI
Cfr10I
EcoNI
FokI
SanDI
SfaNI
StyI
AatII
ApaI
BfiI
BglI
BseMII
BseRI
BsgI
BsrI
BtsI
Hpy99I
PflMI
Sse8387I
TauI
TspDTI
XcmI
Sequence
ACCTGC
GCGATG
RCCGGY
CCTNNNNNAGG
GGATG
GGGWCCC
GCATC
CCWWGG
GACGTC
GGGCCC
ACTGGG
GCCNNNNNGGC
CTCAG
GAGGAG
GTGCAG
ACTGG
GCAGTG
CGWCG
CCANNNNNTGG
CCTGCAGG
GCSGC
ATGAA
CCANNNNNNNNN
TGG
Site
Length
6
6
6
6
5
7
5
6
6
6
6
6
5
6
6
5
6
5
6
8
5
5
6
Overhang
five_prime
five_prime
five_prime
five_prime
five_prime
five_prime
five_prime
five_prime
three_prime
three_prime
three_prime
three_prime
three_prime
three_prime
three_prime
three_prime
three_prime
three_prime
three_prime
three_prime
three_prime
three_prime
three_prime
Frequency
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
Cut Positions
18
182
501
343
241
388
263
395
419
103
469
502
262
238
100
464
403
421
440
359
332
43
33
三、分析蛋白质的分子量、等电点、糖基化、二硫鍵。
分子量为
21977.62
等电点为
5.81
糖基化
>Sequence
2
04 amino acids
#
# netglycate-1.0 prediction results
#
# Sequence
#
Score
Answer
# ------------- ----------------------------------------------
# Sequence
11
0.850
glycate
YES
# Sequence
46
-0.532
glycate
.
# Sequence
53
-0.891
glycate
.
# Sequence
64
-0.820
glycate
.
# Sequence
70
-0.875
glycate
.
#
MAGPATQSPMKLMAL QLLLWHSALWTVQEATPLGPASSLPQSFLLKCLEQ
#
50
VRKIQGDGAALQEKLCATYKLCHPEELVLLGHSLGIPWAPL SSCPSQALQ
#
100
LAGCLSQLHSGLFLYQGLLQALEGIS PELGPTLDTLQLDVADFATTIWQQ
#
150
MEELGMAPALQPT QGAMPAFASAFQRRAGGVLVASHLQSFLEVSYRVLRH
#
200
LAQP
#
250
%1
..... .....G.......................................
#
50
%1
.............................................. ....
#
100
%1
......................................... .........
#
150
%1
.................................. ................
#
200
%1
....
二硫鍵
有二硫键（蛋白质中含有
C
半胱氨酸）
四、写出用
pET-30a
质粒在大肠杆菌中表达的正向和逆向引物序列（含保护碱< br>基、限制性内切酶位点、和基因的特有序列）。
pET-30a
质粒图谱
引物包括
3
个部分组成：
保护碱基、
酶切位点和目的基因的部分序列。
酶切位点的设定要保
证，这 个位点不存在于目的基因中（对照第二题的限制性内切酶位点）
，不存在于载体质粒
的其它位置
（以免破坏了载体本身的性质），
只能存在于载体的多克隆位点里（对照上两张
图片中 的酶切位点）。保护碱基的选择需对照常用限制性内切酶保护碱基表来选择。同时，
还要注意保护碱基和 酶切位点后的碱基个数，必要时可添加碱基，不要产生移码突变。
上游引物：
5
′—
CG GAATTC CG TATGGCTGGACCT
—
3
′
下游引物：
5
′—
CAG AAGCTT GTG GGGCTGGGAA
—
3
′
五、写出基因工程药物研发的基本步 骤（从提取
RNA
到表达出蛋白质所进行的
实验，按研究工作的先后顺序写）。
基因工程药物研发的过程：
提取
RNA
→
cDAN< br>合成→
PCR
扩增目的基因片段→提取质粒→构建重组质粒→转化→鉴别
重组子 →外源基因诱导表达→收集产物蛋白并纯化
提取
RNA
：
分离纯化完整的
RNA
是进行分子 克隆、
基因表达分析的基础。
要成功地提取真核生物
RNA
，
最主要 的是
RNA
的数量和质量，关键在于尽可能完全抑制或去除
RNA
酶的活性， 分离获
得全长的
RNA
。
Trizol
法（试剂盒）
从组织中提取总
RNA
1.
液氮研磨：组织块直接放入研钵中，加入少量液氮，迅速研磨，待组织变软，再加入少量
液氮， 再研磨，如此
3
次。
2.
匀浆：
组织样品按
50 ~100mg
加入
1mlTrizol
，
转移入离心管。
另外，组织体积不能超过
Trizol
的
10%
，用电动匀浆器充分匀浆
1~2min
。
3.12000r/min
离心
5min
，弃沉淀。
4.
按每毫升
Trizol
加入
200
μ
L
氯仿，盖紧 离心管，用手振荡混匀
15s
，室温放置
10min
。
5 .4
℃，
12000r/min
离心
15min
。此时可以看到分为 三层（
RNA
、
DNA
、蛋白质）。
6.
吸取上层水相（含
RNA
），移至另一新离心管中。
7.
按每毫升
Trizol
加入
0.6ml
异丙醇，混匀，室温放置
5~10min
。
8.4
℃，
12000r/min离心
10min
，弃去上清液，
RNA
沉于管底。
9 .
按每毫升
Trizol
加入
1ml
的
75%
乙醇 ，温和振荡，悬浮沉淀。
10.4
℃，
8000r/min
离心< br>5min
，小心尽量弃去上清液。
11.
室温晾干或真空干燥
5~10min
。主页不要过分干燥。
12.
用
50
μ
LDEPC
处理水、
TE
缓冲液或
0.5%SDS
溶解
RNA
样品，
5~60
℃
5~10min
。
13.
测
260nm
下吸光度值定量
RNA
浓度。
可进行
nRNA
分离，或储存于
70%
乙醇中并保存于-70
℃（如要进一步获得
mRNA
可以利用寡脱氧胸腺嘧啶核苷酸纤维素层析，
把
mRNA
与其他的
RNA
分开，
因为几乎所用
的
mRNA
的
3
′端都具有一串可长至
200bp
的
poly
（
A
）序列，而其他的
RNA
上都没有这
样的结构 ）。
cDNA
合成：
cDNA
是从
mRNA
反转录来源的
DNA
，其组成特点是其中不含有内含子和其他调控序列。合成
cDNA
应先从真核生物的组织或细胞中提取
mRNA
，通过反转录 酶的作用产生一条鱼
mRNA
相互补的
DNA
链，然后除掉
mRNA
，以第一条
DNA
链为模板复制出第二条
DNA
链。
（一）
Superscript
Ⅱ
-RT
合成第一链
1.
提取
RNA
2.
在一无
RNase
的
0.2mlPCR
管中加入：
mRNA
（大约
500ng
）
x
μ
L
Xho
Ⅰ引物（
1.4
μ
g/
μL
）
1
μ
L
无
RNA
酶水
12-x
μ
L
总体积为
12
μ
L
3.
混匀后，
70
℃ 反应
10min
，消除二级结构。
4.
反应完全后，立刻将反应体系置于冰上
5min
。
5.
稍微离心一下，顺序加入以下试剂：
5
×第一链缓冲液
4
μ
L
RNA
酶抑制剂
0.5
μ
L
10mmol/LdNTP
1
μ
L
6.
混匀，稍微离心反应物之后，< br>42
℃放置
2min
。
7.
反应完成，趁热加入
1
μ
LM- MLV
反转录酶，混匀。
8.42
℃反应
50min
，然 后
70
℃、
15min
灭活反转录酶。
（二）、
cDNA
第二链的合成
1.
第一链反应完成后，
取
2
μ
L
第一链产物与
-20
℃冰箱中保存，待电泳检测。
其余的产物合并，
混匀，然后顺序加入下列试剂：
10
×
DNA
聚合酶Ⅰ缓冲液
20
μ
L
10mmol/LdNTP
1
μ
L
无
RNA
酶水
x
μ
L
RNase H
（
2U/
μ
L
）
1
μ
L
DNA
聚合酶Ⅰ（
10U/
μ
L
）
10
μ
L
总体系为
200
μ
L
2.
混匀后，
16
℃反应
2.5h
、
3.70
℃灭活
10min
。
4.
反应完成后，得到
200
μ
cDNA
第二链反应体系，将此体系置于冰上。
5.
取
2
μ
L
第二链产物，同保存的第一链产物一起电泳鉴定。同时上
1kb
Ladder
，确定双链的
范围大小。
（三）、双链
cDNA
末端补平
1.
在第二链反应体系中顺序加入下列试剂：
10mmol/LdNTP
6
μ
L
T4 DNA
聚合酶（
8.7U/
μ
L
）
2
μ
L
BSA
（
10mg/mL
）
2
μ
L
2.
稍微离心混匀反应物，
37
℃反应
30min
，然后
75
℃灭活
10min
。
3.
加入等体积酚
/
氯仿
/
异戊醇，剧烈震荡后，常温 下
13000r/min
离心
5min
。
4.
离心后，吸取上清液于另一
1.5mL
Ep
管中，加入等体积 氯仿，上下颠倒几次混匀后，常
温下
13000r/min
离心
5min。
5.
吸取上清液于另一
Ep
管，加入
1/10体积
3mol/L NaAc
（
pH5.2
）和
2.5
体积预冷的无水乙
醇，混匀，
-20
℃防治过夜以沉淀双链
cDNA
。
6.
沉淀物在
4
℃下
13000r/min
离 心
60min
以充分沉淀双链
cDNA
。
7.
弃 上清液，加入
1mL70%
乙醇洗涤沉淀，常温下
13000r/min
离心
5min
。
8.
弃上清液，常温干燥。
（四）、
EcoR
Ⅰ衔接子加接
1.
往双链
cDNA
沉淀中加入
9
μ
L
EcoR
Ⅰ衔接头（
400ng/
μ
L
）
,4< br>℃至少放置
30min
以充分溶
解
cDNA
沉淀。
2.
顺序加入下列试剂：
10
×
DNA
聚合酶Ⅰ缓冲液
1.2
μ
L
10mmol/LdNTP
6
μ
L
T4 DNA
聚合酶（
4U/
μ
L
）
1
μ
L
3.
混匀，
16
℃过夜连接。
（五）、双链
cDNA
末端的磷酸化及
Xho
Ⅰ酶切
1.
连接反应完成后，将反应体系
70
℃放置
15min
灭活< br>T4 DNA
聚合酶。
2.
稍微离心使反应物集中至管底，室温下放 置
5min
。然后加入下列试剂：
10
×缓冲液
1.2
μ
L
10mmol/L dATP
6
μ
L
dd H
2
O
6
μ
L
T4 PNK
（
10U/
μ
L
）
1
μ
L
3.37
℃反应
30min
， 然后
70
℃灭活
15min
。
4.
稍微离心，室温放置
5min
，然后加入下列试剂：
10
×缓冲液
4
μ
L
BSA
（
10mg/mL
）
6
μ
L
dd H
2
O
5
μ
L
Xho
Ⅰ（
10U/
μ
L
）
8
μ
L
5.37
℃反应
1.5h
，然后
65
℃灭活酶
10min
。
6.
反应完成，置于
4
℃准备回收。
（六）、胶回收
cDNA
（
QIAEX
Ⅱ
GEL Extraction Kit
回收试剂盒）
1.
配制
1%
琼脂糖凝胶，
2
μ
L EB/300mL
胶。
2.
取
4
℃保存样品上样，
40
μ
L/
孔，电泳
50V
，
1h
。
3.
紫外灯下分别切下
0.5~1kb
、
1.0~2.0kb
及
2.0~4.0kb cDNA
片段，
分别放入已做标记的
1.5mL
离心管。
4.
称取胶重，加入
3
倍体积
QX
Ⅰ缓冲液。
< br>5.50
℃水浴数分钟，至胶完全融化。用手指弹
QIAEX
Ⅱ使重悬，每管中 加入
5
μ
L QIAEX
Ⅱ。
6.50
℃水浴< br>10min
，每隔
2min
取出颠倒混匀数次，使
QIAEX
Ⅱ保持悬浮。
7.4
℃、
13000r/min
离心
30 s
，弃上清液（吸取上清液）。
8.
加入
500
μ
L QX
Ⅰ缓冲液，轻弹管底使
QIAEX
Ⅱ重悬。
9.
离心并去上清液。
10.
加入
500
μL
缓冲液，重悬
QIAEX
Ⅱ，离心
30s
，去上清液。
11.
再加入
500
μ
L
缓冲液，重悬
QIA EX
Ⅱ，离心
30s
，去上清液。
12.
超净台上吹干< br>（至无乙醇味）
，
加入
10
μ
L
洗脱液，
重 悬
QIAEX
Ⅱ，
静置
5min
，
13000r/min< br>离心
30s
，吸上清液，冰上放置。
13.
取
1< br>μ
L
上清液上样电泳，
同时以相对分子质量标准
（
1kb L adder
）
及
DNA
含量标准
（
10ng
，20ng
）作对照。
14.
收回的
cDNA
置于-20
℃内保存，据电泳结果，取适量
DNA
进行连接。
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