麻醉插管进行性肌营养不良症(DMD)基因检测

2021年1月29日发(作者：颈椎病的并发症)

第三次实验内容

进行性肌营养不良症（
DMD
）基因检测




















一、实验目的：

掌握进行性肌营养不良症基因检测的一种简便方法。

二、实验原理：
PCR
技术具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时，对待检原始材料质量要求低等
特点 ，而多重
PCR
（
multiplex PCR
）则是用几对引物在同一个< br>PCR
反应体系中进行扩增。
这样可以同时扩增出几个不同专一靶区域的片段。

进行性肌营养不良症
(Duchenne
muscular
dystro phy
，
DMD)
是一组原发于肌肉组织的遗
传病，特点是进行性加重的肌肉 萎缩和无力，本病呈
X
连锁隐性遗传，一般男性儿童发病。
临床表现腿的假性肥大，血 清酶学明显升高。

DMD
基因定位于
Xq21.2-21.3
之间 ，全长
2.4kb
左右，有
79
个外显子组成，编码
1
个< br>3685
个氨基酸、分子量为
427
kD
的蛋白质一抗肌营养不良蛋 白
(dystrophin)
，这种蛋白具
有稳定细胞膜和细胞内钙调节的功能。
抗肌营养不良蛋白的编码基因有多种突变形式，
60
％是外显子缺失突变，5
％是重复突
变，另
35
％可能是很小的
DNA
片段缺 失或点突变。通常选择
DMD
基因中
9
个缺失热点的外
显子扩增，可 检出缺失突变中的
90%
。

本实验设计为扩增
DMD
基因 中
4
个外显子（
8,19,45,48
）
，其中外显子
45
和
48
在中国
患者中的检出率分别为
26%
和
48 %
。

三、实验准备：


实验材料：正常对照和
DMD
患者外周血
DNA
样本。

实验器材：

实验试剂：

四、实验步骤：

1
、
正常对照外周血
DNA
样本、
DMD
患者外周血
DNA
样本分别进行
PCR
扩增（第二次
课上已经做好）
。

2
、琼脂糖凝胶电泳。

①

配制
2%
的琼脂糖凝胶

②

取
PCR< br>扩增样品
10
?
l
加入
3
?
l
的< br>6
×载样缓冲液，混匀后，加入样品孔内。

④
140V
，电泳
2
小时左右。

⑤

卸胶，紫外仪上观察电泳条带，判断扩增产物的有无及片段大小。

五、实验结果：

正常对照样本有
4
条带，从负极往正极分别为外显 子
45
、
48
、
19
和
8
。

DMD
患者缺失不同的外显子。

六、注意事项：

1
、引物设计时长度
15
～
30
个碱基为宜，
G +C
含量一般为
40%
～
60%
。

2
、 退火温度决定
PCR
反应的特异性，退火温度高
PCR
反应的特异性好；温度 低，有时会
有非特异性条带。

3
、
Mg2+
浓度对扩增产 物的特异性及产量有显著影响，
Mg2+
浓度低，扩增产物的特异性
好，但有时产量低 ；
Mg2+
浓度高，扩增产物的特异性差，有非特异性条带。