荨麻疹过敏原乙肝表面抗原定量测定的方法学验证

2021年1月29日发(作者：西安最好的男科医院)



乙肝表面抗原的
ELISA
法定量分析






姓名
Z P


学号



班级
09


指导老师



方法学验证

级医学检验本科二班

沈

富

兵



二〇一三年四月
乙肝表面抗原定量测定的方法学验证


作者：
ZP
（成都医学院检验医学院
09
级医学检验本科二班，610500
）


【摘要】

目的


用福州蓝图生物工程有限公司出品的乙肝表面抗原
ELISA
法定量分析试 剂盒对乙肝表面
抗原定量测定的方法进行验证，以判断是否能用于教学以及临床分析。
方法

运用
ELLISA
法定量测定乙
肝表面抗原，应用试剂盒< br>HBsAg
标准从浓度为
8ng/ml
的
2
倍稀释的
6
个浓度梯度，根据
OD
值绘制标准
曲线再计算相对回收率和板内和板间精密 度，
通过资料数据综合分析。
结果


HBsAg
线性较好 ，
其准确度、
精密度、
LOD
值均在正常范内。
结论


ELISA
法定量检测
HBsAg
能较准确、快速地反映体内乙肝 病毒复
制情况，可以用于教学以及临床分析。

【关键词】

乙肝表面抗原


方法学验证



标准曲线


精密度


ELLISA





病毒性肝炎中乙型肝炎的危害较大，我国是病毒性乙 型肝炎的高发流行区，
普通人群的乙型肝炎病毒
(hepatitis
B
virus
，
HBV)
感染率接近
60
％，约占世界
HBV
携带者的
1/3
。
乙型肝炎病毒的病原体不仅具有传染性，
还可能导 致发展成肝
硬化，甚至肝癌，所以乙型肝炎病毒的早期、准确、定量检测对乙型肝炎临床诊
断、 疗效观察及预防具有重要的意义。酶免分析法
HBV
—
EIA
是
HB V
抗原和抗体最
常用的检测技术，其方法简便、价廉，适合一般实验室推广，其中酶联免疫吸附
技术
(enzyme linked immunosorbent assay, ELIS A)
目前应用最为广泛，它常用
聚苯乙烯为固相载体，
使其与待测标本中的相应抗体或 抗原结合，
然后加酶标记
的抗原或抗体，
再加底物显色，
最后根据色泽深浅来 推算待测抗原或抗体的含量。
此方法特异性高，有效测定范围可达到
20500 ng/ml
，且酶免疫法有标记的试剂
比较稳定并且无放射线危害等优点。

我们采用对已知抗体浓度的样品进行
ELISA
的定量检测，通过对其数据的分
析来验 证
ELISA
法最乙肝表面抗原定量检测的准确性和可靠性，
以衡量其实用性。




1
材料与方法

1.1
材料

1.1.1

试剂盒

乙肝表面抗原ELISA
法定量分析试剂盒，福州蓝图生物工程有限公司出品。
1.1.2

仪器及酶标板

酶标仪：
Bio-Rad 680
；洗板机：
Bio-Rad 1575
；超纯水系统：
Millipore Elix
；
电热恒温培养箱< br>(DNP-9052):
上海精宏实验设备有限公司。

1.1.3

溶液配制





⑴
0.01M pH7.4
的
PBS
缓冲液：





称取
8g NaCl
、
0.2g KCl
、
1.44g Na2HPO4
和
0.24g KH2PO4,
溶于
800ml
蒸
馏水中，用
HCl
调节溶液的
pH
值至
7.4
，最 后加蒸馏水定容至
1L
即可。

⑵质控品：





用
PBS
缓冲液将标准品配制成
6
、
3
、
1.5ng/ml
三个质控品，每质控品
1ml
。
首先 取
450
μ
l
的
8ng/ml
的标准品到
C1号
EP
管中再向其中加入
150
μ
l
的
PBS
缓
冲液，即配制成了
6ng/ml
的质控品，再取
300
μ
l
C1
号
EP
管内的溶液到
C2
号
EP
管内，再向
C2
号管内加入
300
μ
l
的缓冲液混 匀。即配制成了
3ng/ml
的质控
品。接着取
300
μ
l
C2
号管内的液体到
C3
号
EP
管内，再加入
30 0
μ
l
的缓冲液混
匀，即配制成了
1.5ng/ml
的质控 品。具体方法如下图
1





























































图
1

C1
6ng/ml
C2
3ng/ml
C3
1.5ng/ml
1.2
检测方法

1.2.1

标准曲线各浓度的配制





⑴用
P BS
缓冲液将标准品配制成
8
、
4
、
2
、
1
、
0.5
、
0.25ng/ml
。


⑵先取
6
个
EP
管分别标记为对应的浓度。

< br>⑶取
400
μ
l
标准品于标记为
?
的
EP< br>管中，
再取
200
μ
l
?
号管内液体于
?< br>号管
内再向
?
号管中加入
200
μ
l
的缓冲 液混匀，即配制成了浓度为
4ng/ml
的标准品。


⑷再从?
号管内取
200
μ
l
的液体到
?
号管内，接 着取
200
μ
l
的缓冲液到
?
号
管内混匀，即配制 成了
2ng/ml
的标准品。





⑸从
?
号管内取
200
μ
l
的标准品到④号管内，再向④号 管内加入
200
μ
l
的缓
冲液混匀，即配制成了
1ng/m l
的标准品。


⑹用同样的方法，配制好浓度分别为
0.5ng/ ml
、
0.25ng/ml.
的标准品体积分
别为
200
μ
l
、
200
μ
l
、
400
μ
l< br>备用。具体方法如下图
2



S1
8ng/ml

S2
4ng/ml


S3
2ng/ml





图
2

S4
1ng/ml

S5
0.5ng/
ml

S6
0.25ng
/ml


1.2.2

测定方法






⑴取出 试剂盒中已包被酶标板，取出板条，在相应孔中加入已配制好的系
列标准品、质控品及空白对照；














图
3

注：双线框区域为标准品
,
浓度依次为
8
、
4
、
2
、
1< br>、
0.5
、
0.25ng/ml
，三线框区域为质控品，浓度依次为< br>6
、
3
、
1.5ng/ml
，粗框区域为空白对照加入的是< br>PBS
缓冲液，每个孔内加入的均是
50
μ
l
。

8
4
2
1
0.5
0.25


8
4
2
1
0.5
0.25


6
6
6
6
6

-

○
-

○
3
3
3
3
3

-

○
-

○
1.5
1.5
1.5
1.5
1.5

-

○
-

○
-

○
-

○
-

○
-

○
-

○
-

○
-

○
-

○




⑵
37
℃温育
30min
，洗板
4
次；





⑶加入酶标抗体，生物素二抗，
50
μ
l/
孔；





⑷
37
℃温育
30min
，洗板
4
次；





⑸加入
A
、
B
液，50
μ
l/
孔，
37
℃温育
15
分钟；





⑹加入终止液，
50
μ
l/
孔。

1.3
标准曲线制作及结果计算





⑴酶标板放入酶标仪，盖上盖子；





⑵在电脑上打开
Microplate Manager 5.2
软件；
< br>⑶选择
450nm
波长（参照波长
630nm
）
，设置
LAYOUT
和报告模式，测定
各孔吸收值；

⑷输入标准品各浓度值，< br>以双对数法制备标准曲线，
获取各孔的浓度值，
打
印标准曲线图和计算结果。< br>
1.4

统计学方法





用
Microsoft Excel
处理实验数据。

2
结果

2.1
测得的
OD
值如下表