怎样治疗阴虱婴幼儿配方食品和乳粉

2021年1月29日发(作者：爱脸红怎么办)
《
婴幼儿配方食品和乳粉

核苷酸的测定》编制说明

引言





核苷酸是构成核酸的成分，
是由含氮的碱基、
核糖或脱氧核糖、
磷酸
3
种分子连接而
成。核 苷酸在人体内广泛分布，具有多种生物学功能：①核苷酸是构成核酸的基本单位，
这是其最主要功能。< br>②参与人体的能量代谢和生理调节。
③促进抗体形成、
增强免疫功能
④组成辅酶 的作用。
一些临床上的研究发现，
添加核苷酸的婴儿配方奶粉，
可减少腹泻的
发生及促进较小胎儿的生长发育。

由于核苷酸对婴幼儿的生长发育具有明显作用，

近几年来，婴幼儿乳粉生产企业在
配方中作为强化成分添加的一定量的核苷酸，并作为卖点在广 告宣传中作为重点大力宣
传。目前婴幼儿配方奶粉中主要添加的核苷酸主要有
5
种：胞嘧啶核苷酸

（
cytidine,
CMP
）
；尿嘧啶核苷酸（
uridine,
UMP
）
；腺嘌呤核苷酸（
adenosine,
AMP
）
；鸟嘌呤核苷
酸（
guanosine,
GMP
）
；次黄嘌呤核苷酸（
inosine,
IMP
）
。一 般在配方中以
3-4
种核苷
酸混合后加入配方粉中。
在现行的国家相应标准中 未对核苷酸含量进行规定，
其检测方法
标准也未建立。
该成分的含量要求都是通过企业 标准在质检部门备案后的企业标准作出的
规定。
由于在婴幼儿配方食品中使用核苷酸的情况国内 外都非常普遍，
在市场销售的国外
独资企业、
进口及国内生产婴幼儿配方粉的大中型企 业都在其婴幼儿配方乳粉中加入了核
苷酸。
虽然核苷酸是婴儿的重要营养素，
对婴儿的 生长发育有重要的作用但有一定的含量
范围，
过低起不到应有的营养作用，
过高则有可 能对婴幼儿的正常生长发育产生不利影响。
所以对产品中核苷酸的质量监控极为重要，
这就需要 相应的检测技术支持。
根据目前报道，
核苷酸检测方法主要有微生物法、
毛细管电泳法 、
高效液相色谱法等。
其中高效液相色谱
法测定核苷酸较适于对象婴幼儿配方乳粉基质 复杂的样品。该方法大多用
ODS
反相色谱
柱的离子对色谱法。
本研究就是 在收集有关资料的基础上，
结合乳制品样品的特点，
选择
离子对反相色谱法进行研究，
建立高效液相色谱法测定乳制品中核苷酸的简便、
准确的检
验方法。


1
、任务来源、起草单位和主要起草人

任务来源：全国乳制品标准化技术委员会

任务编号：


1
本标准起草单位：国家乳制品质量监督检验中心、南京同凯兆业生物技术有限责任公
司

本标准参加单位：上海英特儿营养乳品有限公司、美赞臣营养品（中国）有限公司、
内蒙古蒙牛 乳业（集团）股份有限公司

主要起草人：


2
、制定标准的必要性和意义

2.1
维护消费者健康的需要

核苷酸是构成核酸的成分
,
牛奶中一般不 含有核苷酸，
作为添加剂添加的核苷酸目前
在乳制品中主要用于婴幼儿配方奶粉中。
核 苷酸的主要生理功能是广泛参与人体的能量代
谢、蛋白质合成
,
具有提高各种酶的活性 、活化细胞功能、促进抗体形成、增强免疫功能
的作用。对婴幼儿来说可促进神经细胞的生长发育
,
是与“神经生长因子”有关或者可以
作为神经生长物质利用的营养成分。促进铁质吸收及影 响脂质代谢
,
改变肠道菌丛及提供
肠道黏膜完整所需的营养
,
达到提 升免疫功能的效果。一些临床上的研究发现
,
添加核苷酸
的婴儿配方奶粉
,< br>可减少腹泻的发生及促进较小胎儿的生长发育。但人体对核苷酸的需求
是有一定限度的，并非越多 越好，必须对其用量进行控制。由于核苷酸价格较高，个别企
业添加核苷酸时为降低成本不按配方足量添 加甚至不添加，
有些企业因工艺过程把握不好
造成核苷酸成分损失，
而使得核苷酸含量 不足，
给消费者利益造成损失。
所以为了维护消
费者利益，必须尽快建立适用于乳制品 的检测标准。


2.2
国家政府部门食品安全监管的需要
我国自实施食品质量安全市场准入制度以来，
对规范食品质量安全生产、
保护广大消
费者的利益等起到了极为重要的作用。
其中食品生产许可证审查细则就是审查生产企业是
否符 合要求的法规性文件，
也是企业必须达到的最低要求。
在许可证审查中，
添加核苷酸< br>的产品必须在企业标准中进行规定，
并办证检验合格后方能达到要求。
但对出厂产品质量
是否达到标准要求，在政府监管部门实施各类监督中就必须依据相应的标准方法进行检
测，所以其产品质量的监督必须有相应的技术标准支持，
否则无法有效监管。
由此可看出，制订此检测方法标准的重要性与紧迫性。


2.3
完善国家标准的需要


2
由于核苷酸在婴幼儿食品中使用是近几 年来的事情，在我国现行的标准种尚缺失针对
婴幼儿食品中核苷酸的检测方法标准。这也是完善食品检测 方法国家标准的需要。


3
、起草过程

3.1
前期工作

核苷酸在婴幼儿配方乳粉中使用始于
5
年前。
当 时根据个别企业的要求，
我们于
2003
年开始开展了《反相高效液相色谱法测定乳制 品中核苷酸方法的研究》
，并于当年将研究
成果发表于《中国食品添加剂》
。在以后的
5
年中，婴幼儿配方乳粉生产使用核苷酸的企
业数量剧增，目前有
90%以上的企业都作为营养成分之一添加核苷酸。作为检测机构急需
建立才完善的检测方法并尽快申报国 家标准已成为当务之急。基于这种情况，我们又在
2006
年专门组织技术人员成立研究小组对 原来的检测方法研究进行了分析，从而找出原
方法的缺陷，同时通过各种途径收集相关技术资料，制定了 进一步开展研究的技术路线。
因原方法中采用的是缓冲盐作为流动相，且
5
个组分须采 用不同的流动相分两次进行测
定，
其方法较为繁琐，
若制定为国家标准明显不符合要求 。
为此我们通过论证决定采用离
子对色谱法一次同时测定
5
个组分的技术路线 展开研究，并于
2006
年底初步完成了乳制
品中核苷酸检测技术的研究工作。自2007
年为进一步完善该技术，我们又与南京工业大
学国家生化工程技术研究中心下属专 业生产核苷酸的产业基地—南京同凯兆业生物技术
有限责任公司合作，
利用他们的技术优势，< br>共同对该检测技术进一步实验研究，
通过了大
量实验建立了高效液相色谱法测定乳制品中 核苷酸的方法。
为将该方法能及时上升为国家
标准，
解决乳制品中核苷酸的检测及在婴 幼儿配方乳粉等办证件检验有据可依等问题，
我
们通过全国乳品标准化中心向国家标委会提出立 项的申请，并于
2007
年批准。随后我们
共同组织了标准起草小组，
开展了 按照国家标准制定的要求对方法的适用范围、
采用的标
准、验证方法、准确性、精密度等方面进 行了分析和确认，并于
2007
年底基本完成了实
验室验证工作。
通过验证后 认为此方法操作简单、
准确、快速，基本符合制定国家标准的
条件。


3.2
实验室间验证工作

2008
年
6
月全国 乳品标准化中心在青岛组织召开了乳品系列标准的制修订工作研讨
会。
会上我们提交了由国家乳 制品质量监督检验中心与南京同凯兆业生物技术有限责任公
司共同起草的标准讨论稿，
并对该标 准进行了详细的介绍。
会上一致通过了该标准讨论稿

3
并同意进行方法验 证。根据会议精神，我们邀请了通过
CNAS
认可的实验室美赞臣（广州）
有限公司、
上海英特尔营养乳品有限公司、
内蒙古蒙牛乳业集团股份有限公司等单位与我
中心共同 进行了实验室间的方法验证工作。
通过统计分析各实验室提交的检测数据，
验证
了该方 法的精密度等。
参加验证的实验室一致认为：
该方法用于测定以婴幼儿配方乳粉类
产品 为主的样品中核苷酸的含量，具有测定结果准确可靠，操作简单、快速等特点。


4.
制定标准的原则和依据。

目前报道的检测方法主要有微生物法、毛细 管电泳法、高效液相色谱法等，对于核苷
酸的仪器分析报道较多，多用
ODS
反相色 谱柱，通常采用是离子对反相色谱法。但都不适
合乳品中核苷酸的测定，本研究就是在收集有关资料的基 础上，结合乳制品样品的特点，
选择离子对反相色谱法进行研究，建立了高效液相色谱法测定乳制品中核 苷酸的简便、准
确的检验方法。经实验验证：该方法的准确性、重现性、检出限等完全能满足婴幼儿配方
食品和乳粉中核苷酸含量测定的要求。


5

标准主要条款的说明

5.1
标准名称


本标准的名称定为：
《婴幼儿配方食品和乳粉

核苷酸的测定

》
。


5.2
范围






本标准适用于婴幼儿配方食品、乳粉中五种核苷酸的测定。
（胞嘧啶核苷酸
CMP
、
尿嘧啶核苷酸
UMP
、腺嘌呤核苷酸
AMP
、鸟嘌呤核苷酸
GMP
、次黄嘌呤核苷酸
IMP
）


5.3
样品的处理方法的研究

样品的处理主要考虑的是既能将 样品中的蛋白质分离出去，
又能将核苷酸无损失的提
取出来。
为此我们将样品用水溶解 ，
通过超声波振荡后采用
3
种样品处理方式来沉淀蛋白
质：
10%< br>乙酸、调
pH
值及
0.33mol/L
的高氯酸。
10%乙酸沉淀蛋白和高氯酸沉淀蛋白质
的方法是将充分振荡溶解的样品转入
50mL
容 量瓶中，加入
5mL10%
乙酸或
0.33mol/L
的
高氯酸溶液 ，定容，充分混匀后用滤纸过滤；调
pH
法沉淀蛋白质的方法是先用稀盐酸溶
液将充分 振荡溶解的样品溶液的
pH
调至
1.7
，
静止
1min后再用氢氧化钠调
pH
到
4.5
，
转
入
50m l
容量瓶中定容，混匀，用滤纸过滤。上述滤液通过
0.45
?
m
的 滤膜过滤后上机测

4
定。
通过对测定色谱图进行分析后发现：
上 述
3
种处理方式对色谱图中杂质峰的数量和色
谱峰形及分离度都有有一定的影响：调
pH
沉淀蛋白质的试液杂质峰要多于用乙酸沉淀蛋
白质的方法。
使用高 氯酸沉淀蛋白和乙酸沉淀蛋白效果相近，
但用乙酸沉淀时色谱峰形最
好，而且方便。根据上述处 理样品方法的比较，确定采用
10%
乙酸沉淀蛋白质的样品处
理方法。

5.4
色谱柱及条件的选择

5.4.1
色谱柱的选择：

色谱柱性能是待测物能否达到理想的分离度、方法成功的关键之一。 由于核苷酸为离
子型化合物，采用离子对色谱进行各组分的分离可能会得到理想的结果。

在色谱柱的选择上，
我们先后采用了
AichromBond-AQ C18
柱、
SUPELCOSIL LC-18-T
C18
柱和氨基柱waters
三种色谱柱进行实验。结果发现：使用氨基柱时，
GMP
和
IMP
完
全重叠在一起，没有分开，所有组分在
10min
左右全部流出；使 用
AichromBond-AQ
C18
柱时，由于流动相的细微变化，其中
GMP
和
IMP
有时重叠在一起，有时分离度较差，较
难分离；而
SUPELCOSIL
LC-18-T
可以使五种核苷酸都得到较好的分离。
SUPELCOSIL
LC-18-T
柱添料的硅表面经过特殊的处理，与普通的
C18
柱相比，它可以减 少硅烷醇和核
苷酸之间的相互作用，提高分析的灵敏度，因此我们选用
SUPELCOSIL LC-18-T
柱进行测
定。

5.4.2
流动相的选择

我们主要对流动相进行了优化，即离子对试剂的浓度、流动相
pH
值和甲醇浓度进行
优化。

5.4.2.1
离子对试剂的浓度

我们选用离子对试剂四丁基硫酸氢铵的浓 度分别为
1.30mmol/L
、
1.40mmol/L
、
1.50 mmol/L
、
1.70mmol/L
、
1.75mmol/L
、和
2.0mmol/L
。由试验结果可以看出离子对试剂
浓度变化对核苷酸的出峰顺序、 分离效果及峰形影响很大：当四丁基硫酸氢铵浓度为
1.40mmol/L
时，分离效果最好， 基线分离，峰形对称，且样品中的核苷酸与杂质峰完全分
开，色谱峰的顺序为
CMP
、
AMP
、
UMP
、
GMP
和
IMP
。 因此我们选用离子对试剂的浓度为
1.40mmol/L
。


5.4.2.2
流动相
pH
值的选择

考虑到核苷酸的水 溶液在酸性环境中比较稳定，选择调节流动相的
pH
值为酸性。对
pH
值在< br>4.5
～
6.0
之间进行实验，经过采用不同
pH
值的试验证 明：
pH
为
5.0
时，核苷酸

5
的五个色谱峰 能够完全分开，灵敏度比较高，最终确定选择
pH
为
5.0
。实验表明
pH
值对
色谱峰的分离有很大的影响，因此调流动相
pH
时，一定要精确。


5.4.2.3
甲醇体积分数

在确定离子对试剂的浓 度（
1.40mmol/L
）和流动相的
pH
值（
5.0
） 后，又对含离子对
试剂的缓冲盐溶液与甲醇的体积分数比为
100
：
0
、
100
：
1
、
100
：
2.5
、100
：
4
、
100
：
5
和
100< br>：
10
的流动相进行实验。
实验表明：
加入甲醇的体积对五个组分峰的 保留时间影响
较大，
而且对五个组分峰影响的程度不一样，
并直接影响出峰顺序及分离 度。
结果表明含
离子对试剂的缓冲盐溶液与甲醇的体积分数比为
100
：4
的流动相效果更好。经过实验最
终决定采用含离子对试剂的缓冲盐溶液与甲醇的体积分数 比为
100
：
4
的溶液作为流动相。


标准及奶粉核苷酸色谱图









2.00
25.00
20.00
15.00
1 0.00
Mv

5.00
0.00







CMP














AMP


UMP
GMP



IMP
-5.00
-10.00

4.00

6.00

8.00

10.00

12.00

??

14.00

16.00

18.00

20.00

22.00

24.00


图
1
五种标样色谱图



6
60.00








50.00
40.00
30.00
Mv

20.00






CMP















AMP UMP































GMP


IMP
10.00
0.00
-10.00
2.00

4.00

6.00

8.00

10.00

12.00
??


14.00

16.00

18.00

20.00

22.00

24.00



图
2
样品与样品加标样色谱图


5.5
标准曲线的绘制

将核苷酸标准溶液稀释成不同浓度的标准系列，
分别用不同 浓度的标准溶液进样，
以
浓度为横坐标，
峰高均值为纵坐标，
绘制标准工作曲 线，
通过回归计算求得回归方程和相
关系数，
可见在一定浓度范围内浓度与峰高间呈正 相关，
相关性好，
可用于外标法进行定
量测定。见下表
1
：

表
1

核苷酸标准系列浓度及峰高间回归方程与相关系数

核苷酸

浓度
CMP
?
g/mL


峰高

浓度
AMP
?
g/mL


峰高

浓度
UMP
?
g/mL


峰高

浓度
GMP
?
g/mL


峰高

浓度
g/mL

IMP
?
峰高

浓度
1
浓度
2
浓度
3
浓度
4
浓度
5
7.55
6171
6.65
4387
9.5
5229
3.5
1934
3.5
1335
15.1
12258
13.3
8824
19.0
10433
7.0
3841
7.0
2714
30.2
24970
26.6
17948
38.0
21175
14.0
7834
14.0
5524
60.4
49010
53.2
35996
76.0
42713
28.0
15940
28.0
11147
120.8
96988
106.4
71872
152.0
85538
56.0
30996
56.0
22398
y=401.44x-87.708
1.0000

y=554.97x+66.125
0.9999
y=564.21x-214.13.
1.0000
y=676.87x-102.08
1.0000
回归方程

相关系数
r
0.9999
y=801.28x+371.33

5.6
分析结果的计算

液相色谱法测定样品中核苷酸含量采用在一定浓度的范围内符合比尔定律的原理，通

7
过绘制标准回归曲线的方式，
查出样品待测液中核苷酸的浓度，
从而计算 出样品中的含量。
对于高含量的样品，可通过取样量等方法将核苷酸的浓度控制在适当的范围，保证测定 液
中核苷酸的浓度在线性范围内。


5.7
线性范围

为了确定本标准适用的线性区间，设计实验测定方法线性范围。在允许的范围内，核
苷酸各组分 标准系列浓度分别为：
CMP
0-120
?g/mL

、
AMP
0-100
?g/mL

、
UMP
0-150
?g/Ml、

GMP
0-50
?g/mL、
IMP
0-5
0?g/mL，经验证符合 比尔定律。在操作上直接吸取标准工作液上
机，标准系列浓度测定结果及线性回归方程及相关系数见表< br>1
。


5.8
最低检测限

根据
GB/T5009.1-2003
，中
A 2.1
色谱法的计算方法。计算检出限：






式中：
b
－标准曲线回归方程中的斜率，响应值
/
?g
或响应值
/
ng
；

s
—为仪器噪音的
3
倍，即仪器能辨认的最小的物质信号。

结果：确认样品
CMP
检出限为
1.12 mg/kg
。

样品
UMP
检出限为
1.60 mg/kg
。

样品
GMP
检出限为
1.62mg/kg
。

样品
IMP
检出限为
2.24 mg/kg
。

样品
AMP
检出限为
1.33 mg/kg
。


5.9
准确度

为了确定本方法的准确度
,
根据
GB/T5009.1-2003
，我们选用
3
个样品为试验材料，
加入核苷 酸混合标准溶液，
按照标准讨论稿的方法进行回收率测定，
每个样进行四次重复，
测定 结果见表
2
：







8