蛇葡萄根厌氧菌MIC测定方法

2021年1月28日发(作者：小s代言的减肥产品)
厌氧菌的抗微生物药敏感试验方法

Methods for Antimicrobial Susceptibility Testing of Anaerobic
Bacteria
目次

前言

1.

范围

2.

引用标准

3.

定义

4.

进行厌氧菌敏感试验的指征

5.

厌氧菌敏感试验的局限性

6.

抗微生物药

7.

常规试验和报告中抗微生物药的选择

8.

稀释试验接种物制备

9.

参考琼脂稀释法（
Wadsworth
法）

10.
微量肉汤稀释法

11.
β
-
内酰胺酶试验

1.

质量控制的方法

附录：培养基和补充剂的制备

表
1
：厌氧菌试验应考虑的抗微生物药推荐分组

表
2
：解释标准和相对应最低抑菌浓度（
MIC
）值

表
3
：制备抗微生物药贮存液需要的溶剂和稀释液

表
4
：琼脂稀释法或微量肉汤稀释法敏感试验中抗微生物药稀释液的制备方案

表
5
：参比琼脂稀释试验标质控菌株的最低抑菌浓度（
MIC
）的质 控允许范围

表
6
：微量肉汤稀释试验质控菌株的最低抑菌浓度（
M IC
）的质控允许范围

前言

临床细菌分离中由于厌氧菌感染日渐 增多，
厌氧菌的药敏试验和耐药监测已提到日程上。
本
标

准是在卫 生部颁发的《全国临床检验操作规程》（第三版）的基础上，依据美国国家临
床实验室标准化委员会（< br>National Committee for Clinical Laboratory Stan dards,NCCL
S
）
M11-A5
文件－厌氧菌的抗微生物药敏感试验 方法（已批准的标准－第五版）
[ISBN 1-56
238-429-5]
，结合中国国情及卫生系统的实际情况和要求制定。

本标准从
2004
年

月

日起实施。

本标准由卫生部提出。

本标准起草单位：北京大学人民医院
检验科
。

本标准主要起草人：张正

岳志红。

本标准由卫生部委托卫生部临床检验中心负责解释。

中华人民共和国卫生行业标准


WS/T
×××
-200
×


厌氧菌的抗微生物药敏感试验方法

Methods for Antimicrobial Susceptibility

Testing of Anaerobic Bacteria

1.

范围

本 文件所述方法主要用于测试普通分离到的厌氧菌。
琼脂稀释法可用于测试大多数厌氧
病原菌。< br>目前微量肉汤稀释法仅用于测试脆弱拟杆菌菌群的病原菌。
本标准适用于从事厌氧
菌抗微 生物药敏感试验的临床实验室使用。

1.

引用标准

下 列标准条文主要根据美国
NCCLS
的
M11-A5
文件和中华人民共和国卫 生部医政司编制
的《全国临床检验操作规程》（第三版）而制定。

1.

定义

3.1
琼脂稀释敏感试验

将某一种抗微生物药的系 列浓度混入用于敏感试验的琼脂生长培养基进行的抗微生物药敏
感试验。

3.2
敏感

指该菌株所致感染可以用推荐用于此型感染及病原菌的抗微生物药剂量进行恰当地治疗。

3.3
中介

药物在生理浓集的部位具有临床效力或者可用高于正常剂量的药 物进行治疗；
此还包括一个
“缓冲区”可以防止微小的，未能控制的技术因素造成重大的结果解 释错误。

3.4
耐药

指常规剂量抗微生物药通常达到的浓度不 能抑制该菌株的生长和
/
或该菌株的
MIC
落于某范
围内。在此范围 内，可存在某些特定的耐药机制（如
β
-
内酰胺酶类），并且治疗研究显示
其 临床疗效并不可靠。

3.5
最小抑菌浓度

琼脂或肉汤稀释敏感试验中抗微生物药抑制某一种微生物可见生长的最低浓度。

1.

进行厌氧菌敏感试验的指征

临床上有厌氧菌感染存在，并在实验室分离出厌氧菌，
原则上均应进行抗微生物药敏感
试验。

4.1
常规试验

从脑脓肿、
心内膜炎、骨髓炎、
关节感 染、人工装置或人工血管感染和菌血症分离到的特殊
感染的标本应该测试，并应参考临床医生的合理建议 。

当

感染的性质不清楚，标本含有内源性厌氧菌菌群，而且病原菌与正在 治疗的感染关系很
少时，通常不必做敏感试验。当存在多种厌氧菌时，参考临床情况选择可能引

起厌氧菌感
染的最重要菌种进行敏感试验。一般分离到拟杆菌属、普雷沃氏菌属、梭杆菌属。梭 菌属、
嗜胆菌属和萨顿氏菌属的一些菌种应做敏感试验。

敏

感试 验应使用分纯后菌悬液。不能直接用临床标本进行敏感试验。
MIC
试验一般采用倍
比 稀释，采用本标准推荐方法，做好质控，结果报告采用在实际终点时的一

个倍比稀释范
围内较为科学。例如：终点为
16
μ
g/mL
，真正报告应
8μ
g/ml-32
μ
g/ml
范围更好。并做出
敏感、中介或耐 药判断，以供临床参考。

4.2
监测试验

当技术条件不允许每 个实验室都进行厌氧菌敏感试验时，
建议当地建立参考实验室，
收集一
定量临床菌株（ 不少于
50-100
株），集中测试后公布结果供大家参考。

1.

厌氧菌敏感试验的局限性

体外结果不足以预测某个病人对厌氧菌感染治疗的反应，< br>仅供临床选药参考。
此标准的
试验方法也并不一定适用于所有的厌氧菌，以下
2
点需考虑。

5.1
折点和临床相关

关于确定厌氧菌 对大多数抗微生物药的敏感性的折点，
现在并无一致意见。
目前折点的确定
是基于动物 模型或需氧和厌氧菌多重感染的病人的临床试验结果。
因为大多数厌氧菌感染发
生于密闭空间，
涉及多种微生物，
单一抗微生物药抗单一微生物的体外活性并不直接与其体
内效力相关 。

除数目分布和临床效力之外，
MIC
结果的敏感和中介折点解释是基于 最大的推荐剂量获得的
血清水平，
因为厌氧菌感染通常推荐最大剂量用药。
建立中介范 围是因为有些药物难于判读
终点和
MIC
在折点附近聚集。

5.2
病原菌

琼脂稀释法适用于测试多种不同的厌氧菌。
至今为 止，
微量肉汤稀释法仅限于测试脆弱拟杆
菌菌群。当测试菌呈蔓延生长时
（例如艰难梭 菌或破伤风梭菌），
则需要尽量在琼脂平板上
划开接种物。而对于败毒梭菌，每个平板只能测试 一个分离株。

1.

抗微生物药

6.1
来源

抗微生物药标准品或参考药品可直接来自厂商，或来自中国药品及食品监督管理 局检定所，
或其他商业途径。不应把非肠道的制品用于

敏感试验。可接受的药品应贴 有标签，标明药
品的通用名，
批号，分析活力
（常用每
mg
药品中含
μ
g
或国际单位
（
IU
）
表示）和有效期。
贮存于规定的温度和湿

度中。用时防止冷凝水进入。

6.2
抗微生物药的称量

实验室必须根据该批待用药品的分析结果来标化其抗微生物药溶液 。
抗微生物药品应使用经
计量认证的分析天平称量。公式如下：

重量
(mg)=
体积（
mL
）×所需浓度（
μ
g/mL
）
分析活力（
μ
g/mg
）

或

体积（
mL
）
=
重量
(mg)
×分析活力（
μ
g/mg
）

所需浓度（
μ
g/mL
）

6.3
制备贮存液

抗

微生物药贮存液制备的浓度一般应该至少为
1,000
μ
g/mL(
如
1,280
μ
g/mL)或者是最高
测试浓度的
10
倍。
某些药物必须溶解于非水溶剂中。
此

时，
应使用尽量少的溶剂来溶解抗
微生物药。
最终的贮存液可 用水或表
3
所述的合适的稀释剂进行稀释。
贮存液分装后贮存于
规定温度下， 一般
-60
℃可保存半

年。

6.4
测试浓度的数目

一种特定抗微生物药的测试浓度应包含表
2
所示的 解释性折点，
但实测的浓度数目是由实验
室决定的。
MIC
结果报告推荐选用 五个或更多浓度。建议选用的范围应包涵质控菌株的在控
数值。

1.

常规试验和报告中抗微生物药的选择

敏感试验抗微生物药品种类选择可参考表
1
。在实际应用中，应结合我国实情，参考实
验室所在的临床单位医生及控感科意见做出合适 选择，不断积累经验。

完整的报告单应包括患者一般资料（姓名、性别、年龄和病理号等）。 药品名称应按照我国
药典颁布名称。菌种名称按照卫生部已公布名词标准。应报告敏感、中介和耐药。< br>
1.

稀释试验接种物制备

受试菌应是从强化布氏血琼脂 选择经充足时间孵育（
24-48
小时）产生的合适大小的菌
落。
菌落直径通 常至少
1
毫米。
快速生长菌如脆弱拟杆菌菌群和产

气荚膜梭菌可经
24
小时
孵育后测试，而其它大多数厌氧菌需要
48
小时孵育。对于 缓慢生长的厌氧菌，如嗜胆菌属
和纤细弯曲杆菌，可以从多个琼脂平板制备接种

物以保证标准化的准确。可通过生长法或
直接菌落悬液法制备接种物。

8.1
制备接种物时的浊度标准

为使敏感试验的接种浓度标准化，应使用 一个等同于
0.5
号麦氏（
McFarland
）标准管的
BaSO4
浊度标准管或其光学等同物（如乳胶颗粒悬液）。
BaSO4
的
0 .5
号麦氏标准管制备见附
录。

8.2
分离株的贮存和复苏

8.2.1
冷冻

大多数厌氧菌可在
20
％甘油中在
-60
℃或更低温度保存数年。将四份48
小时肉汤培养物转
移到含有一份无菌甘油的无菌玻璃瓶中。
充分混匀成均一悬 液后冷冻。
预还原时使用不加糖
的疱肉培养基。

另外，也可将
48
小时平板培养的若干菌落直接悬浮于
20
％灭菌脱脂牛奶中，
-60
℃冷冻。

8.2.2
复苏

冻存的分离株必须在强化布氏血琼脂上至少传代两次，用于敏感试验前必须证明其纯度。

1.

生长法

2.

从强化布氏血琼脂选择经< br>24
小时或充足时间孵育产生的合适大小的菌落
（直径至少
1
毫米）。 挑取形态特征完全一致的至少
5
个菌落，或用
3mm
直径的

接种环取满一环，接
种于无指示剂的硫代硫酸盐培养基。
如果此步骤使用厌氧箱，
可 使用强化布氏肉汤，
强化脑
心浸液或
Schaedler
氏肉汤替代硫代硫酸 盐

肉汤。

3.

孵育肉汤
6-24
小时或直至获得足够浊度。

4.
加入布氏肉汤或其它使用前预还原或煮沸后冷却的肉汤，调整浊度等于
0.5
号麦氏
标准。对于大肠杆菌
ATCC25922
或脆弱拟杆菌
ATCC25285
，此时悬液中细菌数约为
1-2
×
10
8CFU/mL
。但应注意到 不同厌氧菌分离株接种大小的变化。

1.

直接菌落悬液法

5.

此法是从孵育了
24-48
小时强化布氏血琼脂平板挑取菌落 。制备悬液时平板在有氧
环境中不应超过
30
分钟。

6.

轻轻挑取形态特征完全一致的至少
5
个菌落，直接转移到布氏肉汤或其它使用前预还原或煮沸后冷却的肉汤，获得相当于
0.5
麦氏标准的浊度。

7.

此法制备厌氧菌的一些菌种菌悬液计数会轻度升高。

8.

参考琼脂稀释法（
Wadsworth
法）

9.1
试剂和材料

9.1.1
厌氧罐（箱）

采用环境含
4-7
％
CO2
厌氧罐（箱），并应有无氧状态指示剂。

9.1.2
强化布氏琼脂

使用的培养基是每
mL
布 氏琼脂中添加
5
μ
g
氯化血红素、
1
μ
g
维生素
K1
和
5
％脱纤维羊血
(v
/v)
。布氏琼 脂的组成和制备，补充剂的制备和添加详见附录。也可提前配制琼脂，使用当
天融化。制备抗微生物药稀 释液后，抗微生物药和脱纤维羊血一起加入到融化琼脂中。

9.2
琼脂稀释平板的制备步骤



开始前，确定抗微生物药及其所用浓 度。制备琼脂稀释平板时，
15
×
100
圆形平板需要
20mL琼脂，
方形平板需要
30mL
。
平板的制备是将一份
10×抗微生物药溶液加入到九份琼脂
中。例如：制备
20mL
琼脂的圆形平板，需要 在
17mL
已添加氯化血红素和维生素
K1
的融化
的布氏琼脂（保持 在
45
℃
-50
℃）中加入
1mL
脱纤维羊血和
2mL10
×抗微生物药溶液。方形
平板则是
25.5mL
布氏琼脂、
1.5mL
脱纤维羊血和
3mL10
×抗微生物

药溶液。

9.2.1
制备琼脂空白

1.
< br>试验前或试验中，
准备足够已添加维生素
K1
和氯化血红素的布氏琼脂，
分配合适的
量到试管中。每种抗微生物药的每个浓度准备一管。

2.
< br>如果试验当天使用，分配后置于
48
℃
-50
℃水浴。如果提前制备， 融化培养基（沸
腾水浴，微波炉或高压锅），置于水浴（
48
℃
-50
℃）中冷却。

9.2.2
制备抗微生物药稀释液

1.

融化以前制备的抗微生物药贮存液，或试验当天制备。

2.

将设计好数量（见表
4
）的灭菌蒸馏水加入相应管中，制备稀释液空白。

3.

使用表
4
所述稀释规则，
1:2
，
1:4
，和
1:8
连续稀释制备中间浓度（
10
×）抗微生
物药溶液，而不是直接倍比稀释。此方法制备稀释液可使稀释错误最小化。

9.2.3
制备琼脂稀释平板

1.

标记制备的每一种抗微生物药的每一种浓度的平板，将平板置于水平台面上。

2.

对于制备的每一种抗微生物药浓度，
将
1mL
脱纤维 羊血
（对于方形平板
1.5mL
）
和
2
mL10
× 抗微生物药溶液（对于方形平板
3mL
）加入到
17mL
融化并冷却的强化 布氏琼脂（对
于方形平板
25.5mL
）试管中。盖紧试管盖子，轻轻翻转数次混匀， 小心不要产生气泡。倒
入平板，固化。

3.

如果测试一种抗微生 物药，应准备另外四个不加抗微生物药的平板，和以上（
2
）相
同的步骤，
但 用灭菌蒸馏水替代抗微生物药溶液。
对于另外测试的每一种抗微生物药，
准备
另外一个 不加抗微生物药的平板。

4.

琼脂固化后，
可将平板盖子半开置 于层流罩或温箱约
30
分钟使其干燥。
或者是翻转
平板将琼脂底盖支在盖子上 。

9.2.4
琼脂稀释平板的贮存

1.

用 于常规试验，试验前密封于塑料袋中于
2
℃
-8
℃贮存，不超过
7< br>天。

2.

用于研究和评估目的，推荐贮存期不超过
72
小时。

3.

含亚胺培南，
克拉维酸或其它已知不稳定的
β
-
内酰胺
/< br>β
-
内酰胺酶抑制剂组合的抗
微生物药的平板必须在试验当天配制。

9.3
接种琼脂稀释平板

接种物接种到琼脂表面的最简便的方法是使用多 点接种器取
1-2
μ
L
接种到琼脂表面。那么
最终琼脂上接种物每点 接近
105CFU
。由于大多数厌氧菌能暂时容忍暴露于氧气，所有操作
可在外界环境 中进行。
一些苛养菌分离株则必需使用预还原平板和在厌氧环境中进行所有操
作。

1.

使微生物生长到浊度等于
0.5
号麦氏标准或将菌落直接制成 悬液到相同浊度，制备
标准化的接种物。

2.

试管按顺序排列在 架子上，将少量体积（约
0.5mL
）移至多点接种器的相应孔中。
在琼脂平板上做标 记，以标明接种点的方位。

3.

小心避免飞溅。

4.

顺序：从最低到最高的药物浓度依次接种。

5.

质控：试验开始时首先接种两个无抗微生物药的对照平板。其中一个平板标记“
pr
e -O2
”（检查需氧菌污染），另外一个平板标记“
pre- Ana
”（厌氧菌最初 生长对照）。每
一系列平板之间，
接种一个无抗微生物药的对照平板做生长对照。
最后 ，
再次接种两个平板，
标记为“
post-O2
”和

“
post-Ana
”，来证实最终病原菌生长力和纯度。

9.4
孵育琼脂稀释平板

1.

平板一旦变干，翻转后置于厌氧罐或替代 厌氧环境中
35
℃孵育
42-48
小时。

2.

有氧孵育平板（证实有氧环境中未能生长）应置于含有
5
％
CO2
环 境中
35
℃孵育
42
-48
小时。

9.5
判读琼脂稀释终点

1.

在黑色不反光的背景下观察每一平板。首 先判读对照平板，寻找需氧菌可能污染或
孔间交叉污染。如果检测到污染，则必需重新测试。

2.

判读
MIC
终点是和厌氧菌对照平板相比生长特征发生显著抑 制的测试平板的浓度。
样本的一个显著生长变化包括薄雾状、多个细小菌落，或一个到数个正常大小菌落 。

3.

微量肉汤稀释法

此法仅适用于测试脆弱拟杆菌菌群。

10.1
试剂和材料

10.1.1
厌氧罐（箱）

附录所述琼脂稀释法条件同样也适用于微量肉汤稀释法。

10.1.2
强化布氏肉汤

布氏肉汤的组成和制备，补充剂的制备和添加详见附录。

10.2
微量肉汤稀释板准备

1.

本法被称为“微量 稀释”是因为使用了小体积的肉汤。这些小体积肉汤被分配到无
菌塑料微量稀释板。每个小孔至少应装< br>0.1mL
肉汤。

2.

为制备（
10
× ）抗微生物药溶液，应将浓缩的抗微生物药贮存液按表
4
所述内容进
行稀释或进行倍比 稀释。将一份
10
×抗微生物药溶液加入到九份肉汤中，得到所需最终浓
度。

3.

制备微量稀释板的最简便方法是使用分配装置。
它可以用至少
10mL
肉汤制成的抗微
生物药稀释液按照每孔
0.1
（±
0.02
）
mL
的量分配到标准的
96
孔中。

4.

加完各种抗微生物药稀释液的微量稀释板应使用塑料袋密封并立即置于冰箱<-20
℃
（最好
<-60
℃）贮存。某些药物如克拉维酸和亚胺培南， 必须贮存在
-60
℃以下。应防止反
复冻融。

10.3
微量肉汤稀释板的接种

使微生物生长到浊度等于
0.5
号麦氏标准 或将菌落直接制成悬液得到相同浊度，
制备标准化
的接种物。

1.

调整好的接种菌悬液最好在
15
分钟内用水或盐水稀释，
接种后每管或每孔大 约含
1
×
106CFU/mL
。
为获得此最终接种物而采取的稀释步 骤，
可因

接种物加到单个孔的加样方法
不同而不同，
因此对于每一 种情况都必须进行计算。
计算时必须知道微量稀释试验要加到孔
内的接种物的确切体积。
例如，
如果孔内培

养基体积是
0.1mL
，
接种物体积 为
0.01mL,
那么
应将
0.5
号麦氏悬液（约
1.5< br>×
108CFU/mL
）按
1:15
稀释以获得
1
×
107CFU /mL
的菌液。当
取
0.01mL
此菌液接种肉汤时 ，细菌的最终测试浓度为
1
×
106CFU/mL(
或
1
×
105CFU/
孔
)
。

2.

按上述方 法对接种物进行标准化后
15
分钟内，
可以用接种装置取体积不超过小孔体
积
10
％的接种物
（如在
0.1mL
抗微生物药液中接种物应≤10? L）
接种微量稀释板的每个孔。
相反，如果用
0.05mL
的吸管，每孔的内 容物将被
1:2
稀释。

3.

为菌落计数，实验室应经常 用脆弱拟杆菌
ATCC25285
练习，以保证技术熟练。

10.4
微量肉汤稀释板孵育

1.

为保证孵育温度，微量稀释板的叠放不应超过四层。

2.

接种好 的微量稀释板应放在厌氧环境中
35
℃孵育
46-48
小时。

3.

应采取措施防止微量稀释板的蒸发。

10.5
判读微量肉汤稀释终点

1.

在黑色，使用间接光无反射光的背景下观察，放大镜可使用。

2.

如果生长对照孔的生长微弱或不生长，则不应判读。

3.

MIC
终点应是观察到的无细菌生长或最显著抑制细菌生长的抗微生物药浓度。一些
药物
/< br>病原菌组合可观察到拖尾效应。

4.

β
-
内酰胺酶试验

在敏感试验之前，
可使用产色头孢菌素 为基础的方法进行除脆弱拟杆菌菌群外厌氧菌
β
-
内酰胺酶活性检测。大多数脆弱拟杆 菌菌群分离株产生
β
-
内酰胺酶，认为对青霉素耐药，
因此不需要常规
β
-
内酰胺酶检测。

1.

质量控制的方法

12.1
目的

质控工作的目的是监测敏感试验步骤的精密度和准确度，试剂和设备的质量，
和进行试验的
工作人员的操作。
为达到上述目的，
最 好选用遗传性稳定和在特定方法中有用的标准参考菌
株。可向国家药品及食品监督管理局检定所菌种库购 买。

12.2
批次的质控

对

于琼脂稀释， 每一批新的培养基、试剂、补充剂或抗微生物药首次使用时应进行所有三
种质控菌株的质控试验。对于自 制的微量肉汤稀释板，每一批至少取一个微量

稀释板孵育
过夜以保证培养基的无菌性 （剩余稀释板可冷冻贮存于
-20
℃，最好是
-60
℃）。对于商业制
备的平板，应依据厂商说明进行质控。

12.3
质控菌株和质控频率
< br>有三种质控菌株常用于质控。
厌氧菌敏感试验时，
琼脂稀释推荐使用以下至少两种质控菌 株
来监测试验步骤。
微量肉汤稀释和临床分离株的常规试验则推荐使用一种或一种以上质控菌< br>株。应使用列于表
5
和表
6
中的限制对试验系统的整体表现进行监控。

脆弱拟杆菌
ATCC 25285
多型拟杆菌
ATCC 29741
迟缓优杆菌
ATCC 43055
12.4
纠正措施

当质控超过特定范围而且结果失控，
应寻找原因
（如使用 了错误的质控菌株，
菌株明显的污
染，或使用了错误的孵育条件或温度等），并做出失控报告， 重新操作直至在控，经科负责
人批准再实施临床检测。