吉林敖东洮南药业股份有限公Transwell趋化实验

2021年1月28日发(作者：做去眼袋手术)
地区：

上海


在
A549
细胞中过表达
human Oct-4
基因，通过对
Oct-4
过表达细胞组、
简介：

空细胞组与阴性对照组进入下室的细胞数量进行测定，研究
Oct-4
基因
对细胞迁 移能力的影响。


提供
oobio

商：

服务名
细胞侵袭


称：

侵袭小室实验

摘要：
在
A549
细胞中过表达
human Oct-4
基 因，通过对
Oct-4
过表达细胞组、
空细胞组与阴性对照组进入下室的细胞数量进行 测定，
研究
Oct-4
基因对细胞迁
移能力的影响。实验结果显示
O ct-4
基因可以促进
A549
细胞的迁移能力。为进
一步深入研究
Oct-4
基因的功能提供实验数据。

关键词：
Oct-4
，
Transwell
，

A549
，细胞迁移

一、

实验原理


Transwell
小室底层的一张有通透性的膜（一般为聚碳酸酯膜），将其放置于孔
板中，小室内称上室，培养板内称下室。由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液
中的成分可以影响到上 室内的细胞。应用
Transwell
可研究下层培养液中的成分
对细胞生长、运动等 的影响。

肿瘤迁移实验：
研究肿瘤细胞的迁移能力或特定情况下肿瘤细胞的迁移能力 。
常
用
8.0
、
12.0?
m
膜，上室种肿瘤细胞 ，下室加入
FBS
或某些特定的趋化因子，
肿瘤细胞会向营养成分高的下室跑，
计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的迁
移能力。

肿瘤侵袭实验：
研究 肿瘤细胞的侵袭能力或特定情况下肿瘤细胞的侵袭能力。
在
聚碳酸酯膜上涂上一层基质胶，模仿 细胞外基质，上室种肿瘤细胞，下室加入
FBS
或某些特定的趋化因子，
细胞要把基质 消化后才可以从上室迁移到下室，
计
数进入下室的细胞量测定细胞的侵袭能力。

二、

实验目的


用质粒
Oct-4-EGFP
转染后的
A549
细胞与正常细胞组、阴性对照组进行比较分
析，考察基因< br>Oct-4
对
A549
细胞的迁移能力产生的影响。

三、

实验步骤


实验共分以下
4
个主要步骤：

1.
质粒转染细胞：

准备
A549
细胞，转染前一天按照
70 -80%
密度铺在
6cm
培养皿中。
16h
后，按
照转染试 剂说明书转染细胞（
8μg
质粒，
20μl lipofectamine 2000
转染试剂）

。

2. Transwell
铺板；

a)
转染
12h
后，
胰酶消化，
收集细胞：

细胞计数后，
每个样品准备
1×
106 cells/mL
。

b) 1,200rpm×
5min
离心后，重悬浮于
1mL
无血清培养基。

c)
湿润小室：

将
300μL
预热的无血清培养基加入到小室中，常温 放置
1~2h
，将
ECM
膜湿润

d)
将小室中 的培养基去掉，
24
孔板中，没有小室的孔中加入
500μL
含
10 %
血清
的培养基

e)
用镊子将小室轻轻放入预先加好培养基的孔中，尽量避免产生气泡

f)
每 个样品取
300μL
，
加入到小室中，
即
3×
105 cells
加入到小室中，
37
℃
，
5% CO2
培养箱中培养


3.
细胞培养及染色；

a)
培养箱中培养
72h
后，取出小室

b)
用棉棒将小室内的细胞和培养基去掉

c) 24
孔板中，没有小室的孔中滴 入
15
滴染色液（约
500μL
）

d)
用镊子将小室轻轻放入预先加好染色液的孔中，尽量避免产生气泡

e)
常温放置
20min
，进行染色

f)
用去离子水洗
3-5
次，将背景洗掉

g)
小室内边缘残留的细胞会影响实验结果，用棉棒擦干

4.
统计分析。

显微镜下拍照，使用
Image-Pro Plus
软件进行细胞计数。

四、

实验结果





图
1.
过表达
Oct-4
对
A549
细胞迁移能力的影响

从左开始依次为
A549
空细胞组，
NC
对照组（过表达
EGFP
），实验组（过表达
Oct-4-EGFP
），每组实验均重复
3
次



图
2.
过表达
Oct-4
对
A549
细胞迁移能力影响的统计分析


**
表示
p<0.01
结论：从实验结果以及进入小室的细胞的 数量统计分析可以发现，
A549
细胞在
过表达
Oct-4-GFP 72h
以后，迁移能力均高于空细胞组以及对照组（
p<0.01
）。

五、

参考文献


1. Koch KR, Zhang CO, Kaczmarek P, Barchi J Jr, Guo L, Shahjee HM, Keay S. The
effect of a novel frizzled 8-related antiproliferative factor on in vitro carcinoma and