小学生喝什么奶粉最全糖化血红蛋白测定的原理与仪器解析

2021年1月28日发(作者：精液少)
.
糖化血红蛋白（
HbA1c
）测定的原理方法与

仪器解析及临床意义

糖尿病目前在世界上发病率很高，占免疫病的比率，在发达国家 高达
2-5%
，而我国糖
尿病的发病率亦达
2-3%
，
并且 每年还以
1
‰的速度增长。
糖尿病是一种终生性疾病，
其并发
症是至 残至死的主要原因，
所以人们希望能尽早发现和治疗糖尿病。
临床上广泛采用血糖参
数 来判定糖尿病，
而血糖参数只代表抽血时的血糖水平，
对确诊有局限性。
近年来的医学 研
究证明：血液中的糖化血红蛋白（
HbA1c
）浓度相对稳定，其浓度值能准确反映 最近
1-3
个
月期间的血糖水平，
便于医生对糖尿病进行早期诊断；
也可用于糖尿病人的血糖监控及慢性
并发症的判断等，
受到临床的广泛重视，
目前我国 各大、
中型医院正逐渐开展糖化血红蛋白
（
HbA1c
）占总血红蛋白（Hb
）的百分含量的测定项目。有些发达国家已将
HbA1c
的测定
列入 中老年人的常规体检项目。测定
HbA1c
比较常用的方法，目前有乳胶凝集反应法和离
子交换高压液相色谱法两种，分别用生化分析仪和糖化血红蛋白自动分析仪进行测定。

1
HbA1c
的临床意义



糖化血红蛋白是一项说服力较 强、
数据较客观、
稳定性较好的生化检查，
不受偶尔一次
血糖升高或降低的影 响。能反应糖尿病患者
2-3
个月以内的糖代谢状况，同时与糖尿病并发
症尤其是微血 管病变关系密切，
在糖尿病学上有重要的临床参考价值。


1
．
1
增高：测定
HbA1c
可以了解糖尿病人在
2
～
3
个月的血糖控制情况。此外，用含葡萄
糖的透析液作血透的慢性肾衰 病人，地中海贫血和白血病病人亦增高。

1
．
2
降低：溶血性及失血性贫血，慢性肾衰，慢性持续性低血糖症等。

1
．
3
作为糖尿病的病情监测指标

1
．
3
．
1
作为轻症、Ⅱ型、
“隐性”糖尿病的早期诊断指标。

1
．
3
．
2
不是诊断糖尿病的敏感指标，不能取代现行的糖耐量试验。

1
．
3
．
3
可以列为糖尿病的普查和健康检查的项目。

1
．
4
当< br>HbA1c
＞
9
％时，
说明患者存在着持续性高血糖，
可以出 现糖尿病肾病、动脉硬化、
白内障等并发症。
临床经常以糖化血红蛋白作为监测指标来了解患者 近阶段的血糖情况，
以
及估价糖尿病慢性并发症的发生与发展情况。
精品

.
1
．
5
对预防糖尿病孕妇的巨大胎儿、畸形胎、死胎，以及急 、慢性并发症发生发展的监督
具有重要意义。

1
．
6
对 于病因尚未明确的昏迷或正在输注葡萄糖（测血糖当然增高）抢救者，急查糖化血
红蛋白具有鉴别诊断的 价值。

1
．
7
对于糖化血红蛋白特别增高的糖尿病患者，
应警惕如酮症酸中毒等急性合并症的发生。

2
临床常用的测定糖化血红蛋白
HbA1c
的方法

2
．
1
乳胶凝集反应法



乳胶凝集 反应法是利用抗原抗体直接测定总血红蛋白
Hb
中的糖化血红蛋白
HbA1c
的
百分含量。目前有国内外几家厂商可以提供
HbA1c
测定的试剂盒。这种免疫反应 是由被测
血样品中的总
Hb
和
HbA1c
与试剂中的抗体结合而形成 凝集，凝集量随
HbA1c
浓度的大小
而变化。使用生化分析仪器来进行比浊测定HbA1c
的浓度，采用终点法，生化仪通过测定
反应液的吸光度值，可直接反映出凝集量 的多少；推算出
HbA1c
占
Hb
的百分含量，测定
时，仪器多采用
660nm
单色光做主波长，
800nm
单色光做副波长，通过标准曲线得出 实测
值。由于这种试验其标准曲线是非线性的，所以在测定前，首先用随试剂盒一起带有的
5< br>种不同浓度的定标液，
做出
5
点非线性标准曲线。
曲线和数值存在生化 仪的贮存器中，
测定
样品时，
实测出的吸光度值
A
与标准曲线比较，
由仪器
CPU
求出实测样品中的
HbA1c
百分
含量。乳胶 凝集反应法测定
HbA1c
简便、不用增加仪器，可直接用自动生化分析对样品进
行快 速测定。该方法也可以用手工的方法，在酶标仪进行测定，是目前使用较多的方法。但
是乳胶凝集反应法 其准确性和重复性均有欠缺。


2
．
2
离子交换高压液相色谱法
HPLC



使用离子交换高压液相色谱
HPLC
（
high
pressure
liquid
chromatography
）来测定
HbA1c
的百分含量目前被认为是分析
HbA1c
的金标准。采用
HPLC
方法工作的 全自动糖化血红蛋
白分析仪器，以其快速、简便、精巧、准确等特点，受到越来越多用户的欢迎。




色谱分析是一类利用混合物的各组分在不同相上的分配差别，在两相物质相对运动过程
中，
将混合物中的各种成份分离开的一种分析技术。
液相 色谱是以液体或固体为固定相，
以
液体为液动相的色谱法的总称。
色谱法又叫色层或层 析，
这一技术在生命科学研究中用于生
物活性物质的分析；
生物活性物质是以混合物形 式存在，
人类血液中的蛋白质有上千种，
只
有把混在一起的被测蛋白分离出来，才能准 确测定；在
HbA1c
的测定时，可以通过高精度
HPLC
，将
Hb A1c
从
Hb
中分离出来，才能得到准确的数值。在生命科学研究中，活性物质
精品

.
的分离主要应用的是液相柱色谱。这种技术诞生于
20
世纪初叶，俄国化学家茨维特把植物
色素混合液置于装有碳酸钙吸附剂的玻璃管顶端，
用石油醚 洗脱后，
在玻璃柱上出现了几组
颜色不同的色带，这些色带随着不断的洗脱，
越分越开 ，
先后从玻璃柱下端流出，
茨维特把
这样一种用流体洗脱色素混合液，使之通过碳酸钙 做固定相从而实现分离的技术，起名叫
精品

.
“色谱法”
。这种 方法被推广用于分离许多混合物中的各种物质，被分离物质已和颜色无关
了，但“色谱”分析的名称仍沿 用至今。当然更贴切的名称应该叫“层析法”
。早期的“色
谱柱”
体积大，
做 固定相的物质颗粒大，
分离时需要大量的洗脱液。
并且洗脱液靠重力流动，
分离时间长 ，效率低。随着科学技术的进步，
20
世纪
60
年代，人们研制出新型液相柱 ，同
时采用高压输液泵自柱上端为洗脱液加压，
大大加速了洗脱液的流速，
开发出相应 的高灵敏
度的检测器，新的分析仪器—高压液相色谱仪在
70
年代诞生，很快就占领了 分析化学的舞
台。特别是在生命科学的研究中，
HPLC
技术由于对被测物活性影响小 ，几乎可以测定生物
医学中所有的非发挥性物质，如近年来利用离子交换
HPLC
法测 定血液中的
HbA1c
的百分
含量，被认为是糖尿病诊断的金标准。


3
糖化血红蛋白自动分析仪



糖化血红蛋 白自动分析仪采用离子交换
HPLC
法测定
HbA1c
。离子交换
H PLC
法，是
利用能交换离子的材料为固定相来分离离子型化合物的方法。仪器使用阳离子交换 柱进行
HbA1c
的百分比测定；当一定量的全血样品被取样针吸入到进样装置内，在稀释部分 被溶
血，释放出红细胞中的血红蛋白
Hb
，并由稀释液稀释，稀释好的已经溶血的样品 ，由高压
泵注入离子交换柱。
柱内的固定相是最新开发的非多孔性，
不溶和可渗透的交 联高聚物，
上
面分布固定的带电荷基团和能游动的配衡离子；
样品通过过滤器从交换柱 顶端加入后，
由三
种不同浓度的盐洗脱缓冲液
（流动相）
洗脱，
使样 品向下移动。
此时溶液中所含血红蛋白
（
Hb
）
的各种组份即与固定 相上能移动的离子进行交换，
样品中的血红蛋白多种组分在固定相上连
续进行可逆的交换吸着和 解吸作用，
而
3
种不同离子浓度的盐液，
形成线性梯度洗脱，
洗脱< br>液
No1
叫起始缓冲液，含低离子浓度的盐，洗脱液
No2
、
No3
缓冲液，其离子浓度依次增
高很多，
这种流动相离子浓度的改变对分离效果的影 响非常明显，
前面洗脱出来的组分分离
效果好，色谱峰很窄，后面组分也能在很短时间内洗脱出 来，
大大缩短了分离时间；所以全
自动血红蛋白分析仪，
在
1
分多钟 内、
Hb
中的多种成份被分离成
6
个部分，
其中的
HbA1 c
、
HbF
、
HbA1
被有效、精确的分离；由交换柱流出的
Hb
成分到达仪器的检测器，检测器内
装有发射单色光的发光二极管，通过双波长可见光比色 法测定
HbA1c
、
HbF
、
HbA1
三个参
数。 仪器的检测器检测出分离后
HbA1c
、
HbF
、
HbA1
组分的吸光度值，与
HbA1c
标准品吸
光度值比较，分析计算出结果，最后以百分率 表示的
Hb
组分结果与色谱图一起打印出来。

精品

.
离子交换柱
HPLC
法对全血直接测定
HbA1c
，其批内和批间变 异系数
CV
均可以小于
1%
（
CV < 1%
）
，
结果精确，
HbA1c
检测结果不受存在的变异型血红蛋白及其衍生物的影响，
特别适合于糖尿病人的监控。

关于糖化血红蛋白的不同的测定方法与正常值之间的关联！

由于现在糖化血红蛋白测 定方法不同，
标注的正常值也不同，
不光患者糊涂，
临床工作
中也不方便。< br>
现在糖化血红蛋白的测定方法有
5
种：
（
1
）离子交换高效液相色谱分析法－检测糖化血
红蛋白
HbA1c
的金标准；
（
2
）电泳法；
（
3
）微柱法；
（
4
）亲 和层析法；
（
5
）免疫法。

比如我们医院以前用的是免疫法，正常 值是
5%-7%
，现在用的是微离子柱层析法（机
器型号是
DREW DS5
）
，
正常值是
6%-8%
，
请教大家这些不同的测定方法得 到的测量值之间
是否有一定的比例关系？国际上有没有糖化血红蛋白测定的统一标准
（测量方法 及测量值）
。

糖化血红蛋白
（
Glycated hemoglobin, GHB
）
实验通常是检测由血红蛋白和葡萄糖经缓慢
过程且 非酶促反应所形成的稳定部分，其合成速率与红细胞所处环境中糖的浓度成正比
,
积
累 并持续于红细胞
120
天生命期中。
由于红细胞允许葡萄糖自由渗透，
血液样 本中糖化血红
蛋白水平反应过去
120
天内的平均血糖水平。
GHB
检测用于常规实验室始于二十世纪七十
年代末期，
且稳定发展至今，
成为评价血糖控制 水平的重要指标。
临床实验室中应用的
GHB
检测方法主要分为两大类，一类方法基于
GHB
与非
GHB
的电荷不同，如离子交换色谱、
电泳和等电聚焦方 法；
另一类方法基于血红蛋白上糖化基团的结构特点，
如亲和层析和免疫
实验，每种方 法各有优缺点，对临床实验室而言，尚无“最佳”方法可以选择。虽然方法不
同，结果的表示不同，但在 正确操作和解释的情况下，方法间可以有较好的相关性，并能为
临床提供有用的信息。

目前在美国进行的糖尿病控制和并发症临床研究（
diabetes control and complications trial,
DCCT
）
，表明了糖尿病患者病程的 发展和合并症与血糖控制的密切关系，及血浆葡萄糖水
平与
HbA1c
水平间的关系。 在此基础上，美国糖尿病协会（
American Diabetes Association
）
提出了糖尿病治疗的建议，指明测定
HbA1c
重要性，并在世界范围内被广泛应 用。为了更
好地应用
DCCT
的结果治疗糖尿病人，为临床医生提供准确的实验室数据 ，美国临床化学
协会（
AACC
）在
1993
年成立分委会进行GHB
测定的标准化工作，使不同实验室（方法）
的结果可溯源至
DCCT
的参考结果。标准化工作由美国国家糖化血红蛋白标准化计划
（
National Glycohemoglobin Standardization Program, NGSP
）
指导委员会于
1996
年完成。
这一
工作使得美国临床实验室间GHB
测定的结果有了大的变化：
2000
年，
90%
实验室以
HbA1c
精品

.
报告糖化血红蛋白的结果，所有参加
NGSP
活动实验室测定结果的室间
C
小于
5%
，
HbA1 c
结果与靶值的偏差小于
0.8%
。目前，美国绝大多数实验室报告的结果，均可溯源 至
DCCT
结果，
使对糖尿病及其并发症的治疗和预防工作有了统一的参考标准。美国临床实验室标准
委员会（
NCCLS
）采纳了
NGSP
的< br>GHB
测定的标准化模式。
精品

.
一、
NGSP
实验室网络

NGSP
由
执
行委
员
会
和实
验
室
网
络
组
成（< br>图
1
）
。
实验
室
网
络
中包
括管
理
核
心
（
NETCORE
）
，一级中心参考实 验室（
CPRL
）
，一级参考实验室（
PRLs
）和二级参考实验< br>室（
SRLs
）
。

管理核心（
NETCORE）负责直接与执行委员会联系，分析全部网络监测数据并转送执
行委员会审批，向合格的实验室或厂 家颁发证书。一级中心参考实验室依据在
DCCT
项目
中使用的方案
[5]< br>，使用
Bio-Rex 70
树脂
HPLC
方法测定
HbA1 c
，建立基准。虽然，采用的方
法有一定缺限（如受
HbF
、变异血红蛋白的 干扰，且测定速度较慢）
，但长期稳定性（
Cs
﹤
3%
）是
NFSP
考虑其作为参考方法的主要依据。一级参考实验室作为中心参考实验室的后
备支持，采 用相同的实验方法，并确保结果可溯源至
CPRL
。其他网络实验室为
SRLs
，可使
用不同的实验方法，但必须溯源至
CPRL
方法。每个
SRL
都应得到
NGSP
相应的证书，并
可直接参与生产厂家的校准工作。

NGSP
实验室网络中的各实验室都必须依据
NCCLS
EP5-A
文件进行方法精密度评估，
并每月参加用新鲜血样本进行的实验室间比对（
n=100
）和依据
NCCLS
EP9-A
文件进行的
偏差评估（表
1）
。
NGSP
实验室网络与各临床实验室和生产厂家协同工作，完成校准、颁发证书和能力验证工作。

二、标准化计划的应用

GHB
测定 标准化计划的目的是：
校准实验室测定方法、
为检测方法和实验室颁发证书、
及指导常 规实验室开展室间质量评价活动。
精品

.
在检测方法获得证书前，
生产厂家必须确保他们的检测结果与实验室网络的结果具有可
比性，
厂家可在网络实验室的帮 助下，达到以上目的。同时，
必须按规定的程序进行方法精
密度检测和室间比对。
在全 部数据经管理核心评审合格后，
可获得合格证书。
检测实验室也
可按相同程序获得相应 证书，参加网络实验室比对检验的实验室可获得“水平
1
”证书，否
则，为“水平2
”证书。

GHB
标准化计划的效益，临床实验室可以通过参加能力验 证活动获得，这种活动通常
使用由网络实验室定值的新鲜血样本，
评估结果的偏差和实验室间及 方法间的可比性。
标准
方法的使用，让实验室检测结果与
DCCT
实验结果结 合起来，从而更好地服务于临床医生
和糖尿病患者。



三、
GHB
测定方法的选择



为保证实验室结 果可以溯源至
DCCT
的结果，且在实验室具有可比性，美国糖尿
病协会（
A DA
）建议只使用
NGSP
验证的
GHB
实验方法
[6]< br>，除具可比较性外，这些方法还
具有较好的精密度，通常总不精密度＜
5%
。< br>GHB
实验的方法原理不同，各有优缺点，影响
因素亦不相同。
临床实验室可根 据所用的方法，
明确易受的干扰因素：
如不同血红蛋白组分、
高
HbF; < br>餐后急性产生的可逆性葡萄糖血红蛋白中间产物
（不稳定
GHB
或
pr e-A1c
）
，
同时，
样本的保存对某些实验方法有较大的影响。

四、
GHB
测定国际标准化

1995
年国际临床化学组织 （
IFCC
）建立了工作组，以研发
HbA1c
测定的原级参考物和
参考方法为目的，在其建立的实验室网络中，使用纯化的
HbA1c
和
HbA0
进行校准，并致
力于建立与
NGSP
网络结果间的联系。
实验结果显示，< br>IFCC
的
HbA1c
结果略低于
NGSP
结
果。在
NGSP
的中心参考实验室内将建立
IFCC
参考方法。

糖化血红蛋白测定方法简述



糖化血红蛋白测定（
glycosylated hemoglobin A
，
GHb
）



成人红细胞中的血红蛋白有< br>HbA
（占
95
％～
97
％以上）
，
HbA 2
（占
2.5
％）
，
HbF
（占
0.2
％ ）
。当
HbA
中的部分血红蛋白被糖基化后，其中由于
HbA
的β链
N
末端的缬氨酸
分子与葡萄糖等己糖分子相结合而使其在血红蛋白电泳中成为
HbA
之前的快泳、
HbA1
组
分，在离子交换柱层析中亦在
HbA
之前首先被洗脱，糖化
Hb
可分为
HbA1a
（其中与
1< br>，
6-
二磷酸果糖结合的为
HbA1a1
；
与
6-< br>磷酸葡萄糖结合的为
HbA1a2
）
，
HbA1b
（尚无明确 定义，
包括
HbA1b1
，
HbA1b2
，
HbA1b3< br>）
，
HbA1e
（与葡萄糖结合）和
HbA1d
（α链和β< br>精品

.
链内氨基以及α链的
N
末端基团上的烯化血红蛋白 ；包括
HbA1d1
，
HbA1d2
，
HbA1d3
）共九种。最重要的是
1e
的生成量取决于血糖的浓度，正常人约占
4
％～
6
％。由
于红细胞的半寿期是
60
天，
所以
GHb
的测定可以反映测定前
8
周左右病人的平均血糖水平。



GHb
测定方法很多，两种最基本的方法是：测定
HbA1
组分和仅测定HbA1c.
高压
液相色谱
（
HPLC
）
法可精确分离
HbA1
各组分；
并分别得出
HbA1a
、
HbA1b、
HbA1c
、
HbA1d
的百分比，
CV3
％，是参 考方法，其次还有低压液相色谱（
LPLC
）
，目前二者均有高精度的
自动化 仪器，作为常规方法用于临床；硼酸亲和柱层析法
CV
（
1
％～
4. 7
％）
，阳离子交换柱
层析法
CV
（
2
％～
16
％）
，测定的血红蛋白类型为
HbA1.
前者在样本量不大的实验室仍 可使
用；
后者在分离过程中对
pH
和温度的要求极高，
HbF
是其干扰因素。
电泳法
CV
（
4
％～
10
％）< br>，
分离
Hb
类型和干扰因素与阳离子交换柱层析法相同；比色法可用于自动生化 仪，无血红蛋
白分离步骤，干扰因素小，具特异性和敏感性，但
CV
较大（
4
％～
18
％）
，且样品用量大，
用浓度单位报告的方式还未被广大临 床医师接受。


一些医院用的糖化设备


1.

糖化血红蛋白分析系统







型号
:HLC-723 G7






HLC-723 G7
是由最新出品的全自动糖化血红蛋白分析仪。
离子交换
HPLC
法是
HbA1c
检测的金标准，得到

NGSP
认证。检测结果准确精密

CV<1%
。
G7
的检测速度 相当快，
每个测试只需
1.2
分钟，它的操作也相当简便，原始试管即可上机测试，无 需人员看护。更
精品

.
有急诊插入功能。日常维护全部自动进行，所有的设计确保最大程度上的解放人力。

精品