上海新虹桥医院细菌的革兰氏染色及染色液的配制

2021年1月27日发(作者：造影疼吗)
革兰氏染色的一般步骤



革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一 种鉴别染色法，
1884
年由丹麦医师
Gram
创立。
未经染色之细 菌，由于其与周围环境折光率差别甚小，故在显微镜下极难观察。染色后细菌
与环境形成鲜明对比，可以 清楚地观察到细菌的形态、排列及某些结构特征，而用以分类鉴
定。

革兰氏染色属复 染法，即将标本固定后，先用结晶紫染色
1
分钟后水洗，然后加革兰碘
液媒染一分钟后 用酒精脱色，再用稀释石炭酸复红复染。染色后除可以看到细菌形态外，还
可将细菌分为两大类，即不被 酒精脱色而保留紫色者为革兰氏阳性菌（
G
）。被酒精脱色复
染成红色者为革兰氏阴性 菌（
Gˉ
）。

革兰氏染色原理尚不肯定，可能与细菌所带核糖核酸、细菌壁 结构通透性、等电点等因
素有关。致病菌如
金黄色葡萄球菌、绿色溶血性链球菌、肺炎球菌、白 喉杆菌、炭疽杆菌
等
属革兰氏染色
阳性菌
。
百日咳杆菌、大肠杆菌（ 大肠埃希菌）、铜绿假单胞菌、伤寒杆菌、
痢疾杆菌、霍乱弧菌、沙门菌、流行性脑膜炎双球菌、淋病双 球菌
等均属革兰氏
阴性菌
。所
以根据细菌的革兰氏染色性质，可以缩小鉴定范 围，有利于进一步分离鉴定，以对疾病做出
诊断。又由于各种抗生素的抗菌谱不同，革兰氏染色尚可做为 选用抗生素的参考。



革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤，具体操作方法是：


1
）涂片固定。


2
）草酸铵结晶紫染
1
分钟。


3
）纯化水冲洗。


4
）加碘液覆盖涂面染
1
分钟。


5
）水洗，用吸水纸吸去水分。


6
）加
95%
酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，
30
秒后水洗，吸去水分。


7
）番红染色液（稀）染
10
秒钟后，纯化水冲洗。干燥，镜检。


＋




染色的结果，革兰氏
正反应
菌体都呈
紫色
，
负反应
菌体都呈
红色
。














实验三

细菌的革兰氏染色法








一、目的要求







了解革兰氏染色的原理，学习并掌握革兰氏染色的方法。







二、基本原理







革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。
它是
1884< br>年由丹麦医师
Gram
创立的。
革兰氏染色法（
Gram stain
）不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为两大类：
染
色反应呈
蓝 紫色
的称为革兰氏
阳性
细菌，用
G+
表示；染色反应呈
红色
（复染颜色）的称为革
兰氏
阴性
细菌，用
G-
表示。
细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结
构不同而造成的。革兰氏阳性细菌的细 胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色
过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构 中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫
-
碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此，呈现蓝紫 色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚
糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细 胞壁的通透性增加，使
结晶紫
-
碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液 （番红）的颜色，因此呈现红
色。







革兰氏染色需用四种不同的溶液：
碱性染料
（
basic dye
）初染液；
媒染剂
（
mordant
）
；
脱色剂< br>（
decoorising agent
）和
复染液
（
cou nterstain
）
。

碱性染料初染液的作用象在细菌的单染色法基本原 理中所述的那样，而用于
革兰氏染
色的初染液一般是结晶紫
（
crysta
vioet
）
。媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或附
着力，即以 某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落，碘（
iodine
）是常用的媒染剂。脱
色剂是将被染色的细胞进行脱色，不同类型的细胞脱色反应不同，有的能被脱色，有的则不
能，脱色剂 常用
95
％的酒精（
ethano
）
。复染液也是一种碱性染料，其 颜色不同于初染液，复
染的目的是使被脱色的细胞染上不同于初染液的颜色，而未被脱色的细胞仍然保持 初染的颜
色，从而将细胞区分成
G+
和
G-
两大类群，常用的复染液 是
番红
。







三、器材







大肠杆菌，金黄色葡萄球菌；







草酸铵结晶紫，番红水溶液，碘液，
95%
乙醇，载玻片，显微镜等。







四、操作步骤







1
．涂片

将培养< br>24
小时的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌分别作涂片（注意涂片切不可过于浓厚）
，
自然干燥、固定。
固定时通过火焰
1
～
2
次即可
，不可过 热，以载玻片不烫手为宜。







2
．染色







（
1
）初染：滴加结晶紫（以刚好将菌膜覆盖为宜）一滴，染色
1-2min
，倾斜后缓慢冲
洗，用吸水纸吸干。







（
2
）媒染：滴加碘液冲去残水，并覆盖约一分钟，倾斜后缓慢 冲洗，吸水纸吸干。







（< br>3
）脱色：将载玻片上面的水甩净，并衬以白背景，倾斜玻片，用
95
％酒精滴 洗至流
出酒精刚刚不出现紫色时为止，约
20
～
30
秒钟，立即用水 冲净酒精。







（
4
）复染：用番红液染
1
～
2
分钟，水洗。







（
5
）镜检：自然干燥后，置 油镜观察。革兰氏
阴性
菌呈
红色
，革兰氏
阳性
菌呈
紫色
。
以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性。







（
6
）同法在一载 玻片上以大肠杆菌与金黄色葡萄球菌
混合制片
，作革兰氏染色对比。








注意：
革兰氏染色的关键在 于严格掌握酒精脱色程度，如脱色过度，则阳性菌可被误
染为阴性菌；而脱色不够时，阴性菌可被误染为 阳性菌。此外，菌龄也影响染色结果，如阳
性菌培养时间过长，或已死亡及部分菌自行溶解了，都常呈阴 性反应。







五、实验结果与讨论



微生物染色液的配制


一、吕氏
(Loeffler)
碱性美蓝染液



A
液：美蓝
(methylene blue) 0
．
6g


95%
酒精
30ml


B
液：
KOH 0
．
01g



蒸馏水
100ml



分别配制
A
液和
B
液，配好后混合即可。


二、齐氏
(Ziehl)
石炭酸复红染色液



A
液：碱性复红
(basic fuchsin) 0
．
3g


95%
酒精
10ml


B
液：石炭酸
5
．
0g



蒸馏水
95ml



将碱性复红在研钵中研磨后，逐 渐加入
95%
酒精，继续研磨使其溶解，配成
A
液。




将石炭酸溶解于水中，配成
B
液。




混合
A
液及
B
液即成。通常可将此混合液稀释
5
—
10
倍使用，稀释液易变质失效，一次
不宜多配。


三、革兰氏
(Gram)
染色液



1
．草酸铵结晶紫染液



A
液：结晶紫
(crystal violet) 2g


95%
酒精
20ml


B
液：草酸铵
(ammonium oxalate) 0
．
8g



蒸馏水
80ml



混合
A
、
B
二液，静置
48
小时后使用。




2
．卢戈氏
(Lugol)
碘液




碘片
1
．
0g



碘化钾
2
．
0g



蒸馏水
300ml



先将碘化钾溶解在少量水中， 再将碘片溶解在碘化钾溶液中，待碘全溶后，加足水分即
成。





3
．
95%
的酒精溶液
(
脱色用
)。





4
．番红复染液




番红
(safranine O) 2
．
5g


95%
酒精
100ml



取上述配好的番红酒精溶液
10ml
与
80 ml
蒸馏水混匀即成。


四、芽孢染色液



1
．孔雀绿染液




孔雀绿
(malachite green) 5g



蒸馏水
100ml



2
．番红水溶液




番红
0
．
5g



蒸馏水
100ml



3
．苯酚品红溶液




碱性品红
11g



无水酒精
100ml



制法取上述溶液
10ml
与
100ml5%
的苯酚溶液混合，过滤备用。




4
．黑色素
(nigrosin)
溶液




水溶性黑色素
10g



蒸馏水
100ml



称取
10g
黑色素溶于
100 ml
蒸馏水中，置沸水浴中
30
分钟后，滤纸过滤二次，补加水
到
1 00ml
，加
0
．
5ml
甲醛，备用。


五、荚膜染色液



1
．黑色素水溶液




黑色素
5g



蒸馏水
100ml



福尔马林
(40%
甲醛
) 0
．
5ml



将黑色素在蒸馏水中煮沸
5
分钟，然后加入福尔马林作防腐剂。




2
．番红染液




与革兰氏染液中番红复染液相同。


六、鞭毛染色液



A
液：单宁酸
5g


FeCl3 1
．
5g



蒸馏水
100ml



福尔马林
(15%) 2
．
0ml


NaOH(1%) 1
．
0ml



配好后，当日使用，次日效果差，第三日则不宜使用。



B
液：
AgNO3 2g



蒸馏水
100ml



待
AgNO3
溶解后，取出
1 0ml
备用，向其余的
90mlAgNO3
中滴入浓
NH4ON
，使 之成为很浓
厚的悬浮液，再继续滴加
NH4OH
，直到新形成的沉淀又重新刚刚溶解为 止。再将备用的
10mlAgNO3
慢慢滴入，则出现薄雾，但轻轻摇动后，薄雾状沉淀又消失 ，再滴入
AgNO3
，直到
摇动后仍呈现轻微而稳定的薄雾状沉淀为止。如所呈雾不重 ，此染剂可使用一周，如雾重，
则银盐沉淀出，不宜使用。


七、富尔根氏核染色液



1
．席夫氏
(Schiff)
试剂




将
1g
碱性复红加入
200ml
煮沸的蒸馏水中，振荡
5
分钟，冷至
50
℃左右过滤，再加入
1mol/LHC120ml
，
摇匀。
待冷至
25
℃时，
加
Na2S2O5(
偏重亚硫酸钠
)3g
，
摇匀后装在棕色瓶中，