实验五 固体发酵纤维素酶米氏常数Km的测定

2021年1月26日发(作者：邓垦)
实验五



固体发酵纤维素酶米氏常数
Km
的测定


一、目的


了解纤维素酶的种类和测定原理，掌握其活力的测定方法。

二、原理






纤维素酶在一定温度和
pH
条 件下，
将纤维素底物
(
滤纸
)
水解，
释放出还原糖。
在碱性、
煮沸条件下，
3
，
5
一二硝基水杨酸
(DNS< br>试剂
)
与还原糖发生显色反应，其颜色的深浅与还
原糖
(
以葡 萄糖计
)
含量成正比。
通过在
540

run
测 其吸光度，
可得到产生还原糖的量，
计算
出纤维素酶的滤纸酶活力。以此代表纤维素酶 的酶活力。

酶活定义





以滤纸 为底物，在一定反应条件（
50
℃，
pH4.8
，恒温
1h
）下，以水解反应中每小时催
化底物水解形成
1μmol
葡萄糖的酶量为一个单位（< br>U
）
。

三、试剂和溶液

(
一
)
除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度
的水。
1 DNS
试剂






称取
3
，
5
一二硝基水杨酸
(10
士
0. 1)g
，
置于约
600

mL
水中，
逐渐加入氢 氧化钠
log
，
在
50
℃水浴中
(
磁力
)
搅拌溶解，再依次加入酒石酸甲钠
200

g
、苯酚
(< br>重蒸
)2g
和无水亚硫
酸钠
5g
，待全部溶解并澄清后，冷却 至室温，用水定容至
I 000mL
，过滤。贮存于棕色试剂
瓶中，于暗处放置
7d
后使用。

2
柠檬酸缓冲液，
0.

05

mol/L

pH

4.8(
适用于酸性纤维素酶
)





称取一水柠檬酸
4.83

g
，
溶于约
750

mL
水中，
在搅拌 情况下，
加入柠檬酸三钠
7.94g
，
用水定容至
1000

mL
。调节溶液的
pH
到
(4.8
士
0 .05)
备用。






注
:
也可采用
pH4.8
乙酸缓冲溶液
:
称取三水乙酸钠
8.
16
g
，溶于约
750
ml
，水中，加
入乙酸
2.31 ml
，用水定容至
1 000 ml.
调节溶液的
pH
到
(4.810.05)
备用

3
葡萄糖标准贮备溶液（
4mg/ml
）同实验四

上述系列浓度应根据需要自行调整。

.5
快速定性滤纸
(
杭州新华一号滤纸
)
沪
15

cm(
每批滤纸，使用前用标准酶加以校正
)
。

(
二
)
仪器






除普通实验室仪器外，还应有
:
1
分光光度计




2
酸度计精度
10.01

pH






3
恒温水浴

(50
士
0.l)0C
4
分析天平感量
0.1

mg





5
磁力搅拌器







6
秒表或定时钟

7
沸
7k
洛
(
可用
800W
申炉和高脚烧 杯、
楠夸量杯或茸楠奔器切成
)

8
具塞刻度试管
25

mL
四、操作步骤

4.1
绘制标准曲线






按表
A.

l规定的量，分别吸取葡萄糖标准使用溶液
(A.2.5)
、缓冲溶液
(A.2.2
或
A.2.3)
和
DNS
试剂
(A.2.1)
于各 管中
(
每管号平行作
3
个样
)
，混匀。






将标准管同时置于沸水浴中，反应
10

min
。取出，迅速冷却至室温，用水定容至
25

mL.
盖塞，混匀。用
10

mm
比色杯，在分光光度计波长
540

n
处测量吸光度 。以葡萄糖
量为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，获得线性回归方程。线性回归系数应在0.9990
以上时方可使用
(
否则须重做
)
。