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碱性磷酸酶米氏常数的测定

作者:陕西保健网
来源:http://www.xapfxb.com/yuer
更新日期:2021-01-26 03:16

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2021年1月26日发(作者:祝维诰)
仅供个人参考

For personal use only in study and research; not for commercial use

碱性磷酸酶米氏常数的测定

【实验目的】通过碱性磷酸酶(
alkaline
phosphatase

AKP
)米氏常数的测定,了解其测定
方法和意义。
学会运用标准曲线测定 酶的活性及观察抑制剂对酶促反应动力学的影响,
加深
对酶促反应动力学的理解。

【实验原理】本实验以磷酸苯二钠为底物,由碱性磷酸酶催化水解,生成游离酚和磷酸盐。
< br>酚在碱性条件下与
4-
氨基安替比林作用,经铁氰化钾氧化,生成红色的醌衍生物,颜色 深
浅和酚的含量成正比。
根据吸光值的大小可以计算出酶的活性,
也可以从标准曲线上 查知酚
的含量,进而算出酶活性的大小。

【实验步骤】
1.
底物浓度对酶促反应速度的影响

(1)


6
支 试管,作好标记。按下表操作:

未加抑制剂组




6
管号

试剂
/ml

支试管,



1

2

3

4

5

6

记。
按下
0.01 mol/L
底物液


0.10

0.20

0.30

0.40

0.80

0.0

表操作:
pH10.0, 0.1 mol/L
碳酸盐缓冲液


0.70

0.70

0.70

0.70

0.70

0.70





蒸馏水


1.10

1.00

0.90

0.80

0.40

1.20

氨酸组

37
℃水浴中保温
5
分钟

AKP
酶液


最终底物浓度
(mmol/L)

试剂
/ml

0.10

0.10

0.10

0.10

0.10

0.10

0.5

1.0

1.5

2.0

4.0

0.0

管号

1

2

3

4

5

6

0.01mol/L
底物液


0.10

0.20

0.30

0.40

0.80

0.0

5mmol/L
高精氨酸溶液

0.10

0.10

0.10

0.10

0.10

0.10

pH10.0,0.1 mol/
碳酸盐缓冲液


0.70

0.70

0.70

0.70

0.70

0.70

蒸馏水


1.05

0.95

0.85

0.75

0.35

1.15

37
℃水浴中保温
5
分钟

AKP
酶液


0.10

0.10

0.10

0.10

0.10

0.10

最终底物浓度
(mmol/L)

0.5

1.0

1.5

2.0

4.0

0.0

(2)
加入酶液
(0.05
μ
g/ml)

,< br>各管混匀并立即记录时间
,
将上述各管置
37
℃水浴中准确保

15
分钟。

(3)
保温结束,立即加碱性溶液
1.1 ml
终止反应。

(4)
各管分别加入
0.3% 4-
氨基安替比林
1.0 ml

0.5%
铁氰化钾
2.0 ml
,充分混匀,放置
10
分钟,以
6
号空白管作对照,于
510 nm
波长处比色,根据酚标准曲线计算酶活性。

(5)
以各管基 质浓度的倒数
1/[S]
为横坐标,
以各管吸光度值的倒数或者以酶活性单位的倒数为
1/V
做横坐标,作图求出
Km
值。

2.
酚标准曲线的绘制

(1)
取洁净干燥试管
6
支,按下表依次加入试剂:

(2)
混匀后室温放置
15
分钟,于
510 nm
波长处比色。

(3)
以酚含量(
μ
g
)为横坐标,吸光度值为纵坐标,绘制酚标准曲线。

试剂
/ml

管号

不得用于商业用途

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