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碱性磷酸酶米氏常数的测定
【实验目的】通过碱性磷酸酶(
alkaline
phosphatase
,
AKP
)米氏常数的测定,了解其测定
方法和意义。
学会运用标准曲线测定 酶的活性及观察抑制剂对酶促反应动力学的影响,
加深
对酶促反应动力学的理解。
【实验原理】本实验以磷酸苯二钠为底物,由碱性磷酸酶催化水解,生成游离酚和磷酸盐。
< br>酚在碱性条件下与
4-
氨基安替比林作用,经铁氰化钾氧化,生成红色的醌衍生物,颜色 深
浅和酚的含量成正比。
根据吸光值的大小可以计算出酶的活性,
也可以从标准曲线上 查知酚
的含量,进而算出酶活性的大小。
【实验步骤】
1.
底物浓度对酶促反应速度的影响
(1)
取
6
支 试管,作好标记。按下表操作:
(
未加抑制剂组
)
另
取
6
管号
试剂
/ml
支试管,
做
好
标
1
2
3
4
5
6
记。
按下
0.01 mol/L
底物液
0.10
0.20
0.30
0.40
0.80
0.0
表操作:
pH10.0, 0.1 mol/L
碳酸盐缓冲液
0.70
0.70
0.70
0.70
0.70
0.70
(
高
精
蒸馏水
1.10
1.00
0.90
0.80
0.40
1.20
氨酸组
)
37
℃水浴中保温
5
分钟
AKP
酶液
最终底物浓度
(mmol/L)
试剂
/ml
0.10
0.10
0.10
0.10
0.10
0.10
0.5
1.0
1.5
2.0
4.0
0.0
管号
1
2
3
4
5
6
0.01mol/L
底物液
0.10
0.20
0.30
0.40
0.80
0.0
5mmol/L
高精氨酸溶液
0.10
0.10
0.10
0.10
0.10
0.10
pH10.0,0.1 mol/
碳酸盐缓冲液
0.70
0.70
0.70
0.70
0.70
0.70
蒸馏水
1.05
0.95
0.85
0.75
0.35
1.15
37
℃水浴中保温
5
分钟
AKP
酶液
0.10
0.10
0.10
0.10
0.10
0.10
最终底物浓度
(mmol/L)
0.5
1.0
1.5
2.0
4.0
0.0
(2)
加入酶液
(0.05
μ
g/ml)
后
,< br>各管混匀并立即记录时间
,
将上述各管置
37
℃水浴中准确保
温
15
分钟。
(3)
保温结束,立即加碱性溶液
1.1 ml
终止反应。
(4)
各管分别加入
0.3% 4-
氨基安替比林
1.0 ml
,
0.5%
铁氰化钾
2.0 ml
,充分混匀,放置
10
分钟,以
6
号空白管作对照,于
510 nm
波长处比色,根据酚标准曲线计算酶活性。
(5)
以各管基 质浓度的倒数
1/[S]
为横坐标,
以各管吸光度值的倒数或者以酶活性单位的倒数为
1/V
做横坐标,作图求出
Km
值。
2.
酚标准曲线的绘制
(1)
取洁净干燥试管
6
支,按下表依次加入试剂:
(2)
混匀后室温放置
15
分钟,于
510 nm
波长处比色。
(3)
以酚含量(
μ
g
)为横坐标,吸光度值为纵坐标,绘制酚标准曲线。
试剂
/ml
管号
不得用于商业用途
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