酶工程实验报告五(纤维素酶米氏常数—Km的测定)

2021年1月26日发(作者：韩振祥)

实验名称

实验方式

小组成员

XX
实验五：纤维素酶米氏常数——
Km
的测定

小组合作

XX
XX
XX
1
、

实验目的

1.1

了解底物浓度对酶促反应的影响。

1.2

掌握测定米氏常数
Km
的原理和方法


2
、

实验仪器、试剂和溶液：

2.1
仪器：

紫外分光光度计、比色皿（
3
个）
、恒温水浴锅、 试管架（
1
个）
、
l
移液管、洗耳球、
标签（若干）等。< br>

2 .2
试剂和溶液

2 .2
.1
柠檬酸钠缓冲液，
0.05mol/L
，
pH4.8
2 .2.2
10mg/ml
的
CMC-Na
溶液（底物溶液）

2 .2
.3 DNS
试剂（
CMCA-DNS
）

2 .2.4
稀释到
200
倍的纤维素酶液

3
、实验原理或装置示意图：

3.1

原理
: Km
定义：







Km
值等于酶促反应速度达到最大反应速度一半时所对应的底物浓度。

3.2

Km
的意义







Km
是酶的特性常数之一，不同的酶
Km
值不同，同一 种酶与不同底物反应
Km
值也
不同。



Km
值可近似的反应酶与底物的亲和力大小：

Km
值大，表明亲和 力小；
Km
值小，
表明亲和力大。测定
Km
值是酶学研究的一个重要 方法。大多数纯酶的
Km
值

在
0.01-0.00001mmol /L
。（
0.01
～
100mol/L
）


1


3.3

米氏方程：

















V[S]












v =






Km + [S ]









v
：

反应初速度





（微摩尔浓度变化
/min)




V
：

最大反应速度

（微摩尔浓度变化
/min)




[S]
：

底物浓度








（
mol/L)




Km
：

米氏常数








（
mol/L)








此方程表明，当已知
Km
及
V
时，酶反应速度与底物浓度

之间的定量关系。


3.4
双倒数作图法测定
Km
值：





1









Km

1









1




v










V


[
S
]








V















1 /v
对
1/[S]
作图可得一条曲线，其斜率为
Km/Vmax
，截 距为
1/Vmax
。若将直线延
长与横轴相交，则该交点在数值上等于
-1 /Vmax
。

本实验采用最适
pH
、最适温度下，测定不同浓度时 酶活性。再根据林贝法作图求出
Km
值。

3.5

纤维 素酶水解纤维素产生的纤维二糖、葡萄糖等还原糖能将碱性条件下的
3
，
5-
二
硝基水杨酸（
DNS
）还原，生成棕红色的氨基化合物，在
540nm波长处有最大光吸收，
在一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度呈比例关系，利用比色法测定其 还原糖生
成的量就可测定纤维素酶的活力。




2

4
、实验方法步骤、操作流程及注意事项：

4 .1
实验方法与步骤：

1
、将预先准备好的
200
倍纤维素酶 液酶准确稀释到
10000
倍待用。

2
、每个底物浓度取三支
250
ml
试管，一直空白，两只对照，待用。

3
、预热：



参照下表：









表一










纤维素酶
Km
值的测定各管中底物液、缓冲液和酶液的用量
ml




















































CMC-Na
溶液
（
10 mg/ml
）


pH4.8
柠檬酸钠缓冲液



酶液



最终
CMC- Na
浓度
（
g/ml
）


0.2






















1.8













0.5











1
0.4






















1.6













0.5











2
0.6






















1.4













0.5











3
0.8






















1.2













0.5











4
1.0






















1.0













0.5











5
1.2






















0.8













0.5











6
1.4






















0.6













0.5











7
1.6






















0.4













0.5











8
1.8






















0.2













0.5











9
2.0






















0.0













0.5










10
注：
DNS
与定容用的蒸馏水分别为：
3 ml
，
19.5 ml
。























（
1
）
按上述配制方 法分别将
不同浓度
底物
2
ml
底物
（
mg/ml< br>）
和稀释到
10000
倍纤维素
酶液于
50
℃
水浴中保温
10min
。

（
2
）准确计时后，将保温后的酶液各取
0.5
ml
迅速加入保温后的不同浓度底物溶液
中，振荡混匀，并立即用秒表计时，在
50
℃
水浴中继续保温
30 min
。

3
、测定步骤


（
1
）
反应混合物物保温

30min
后，
于各个浓度底物试管中加入
3mLDNS
试剂终止
液，迅速振荡均匀。

（
2
）于不同底物浓度的空白对照试管中加入
0.5
ml
的酶液。

（
2
）将各底物浓度的三支试管沸水浴
5min
，自来水冷却后，加蒸馏水
19.5mL
。摇
匀，在
540nm处读取
OD
值。

4
、作图分析：

以
1/v
对
1/[S]
作一条曲线，求截距为
1/Vmax
。

注：本实验在纤维素酶最适反应条件
50
℃、
pH 4.8
下测定不同底物浓度的纤维素酶

3

km
值。

4.2

操作流程：









A
稀释
:



原酶液








底物

↘



↙

B
预热

:
各预热
10min
↙



↘

C
取液

:
稀释到
10000
倍的纤维素酶液
0.5mL


2mL
不同浓度的底物溶液






























↓



























D
反应



50
℃
水浴中保温
30min
↓


F

测定




①
3mLDNS
反应终止
→


②
沸水浴
5min

→

③定容至
25ml
→

④测定
OD540
吸光值




















G


作双倒数图求
Km
4.3
实验注意事项





















本实验是一个 定量测定方法，为获得准确的实验结果，应尽量减少实验操作中带来
的误差。底物溶液时应用同一母液进 行稀释，保证底物浓度的准确性。严格控制准确
的酶促反应时间。

①
反应温度准确，酶液准确稀释。不同
pH
所用酶液用对应
pH
缓冲液稀释

②试管上编号：贴上用圆珠笔写上编号的胶布，以防止保温或沸水加热时脱落；

③移液管使用时量取精准，保证结果可靠准确。

④精确记时：每一管加入酶液的时间要做记录，每管之间间隔的时间要合理；

⑤避免试管进水：煮沸和用流水冲洗时；

5
、实验结果与数据处理：


4