没有打蛋器怎么将蛋清打发-
实验名称
实验方式
小组成员
XX
实验五:纤维素酶米氏常数——
Km
的测定
小组合作
XX
XX
XX
1
、
实验目的
1.1
了解底物浓度对酶促反应的影响。
1.2
掌握测定米氏常数
Km
的原理和方法
2
、
实验仪器、试剂和溶液:
2.1
仪器:
紫外分光光度计、比色皿(
3
个)
、恒温水浴锅、 试管架(
1
个)
、
l
移液管、洗耳球、
标签(若干)等。< br>
2 .2
试剂和溶液
2 .2
.1
柠檬酸钠缓冲液,
0.05mol/L
,
pH4.8
2 .2.2
10mg/ml
的
CMC-Na
溶液(底物溶液)
2 .2
.3 DNS
试剂(
CMCA-DNS
)
2 .2.4
稀释到
200
倍的纤维素酶液
3
、实验原理或装置示意图:
3.1
原理
: Km
定义:
Km
值等于酶促反应速度达到最大反应速度一半时所对应的底物浓度。
3.2
Km
的意义
Km
是酶的特性常数之一,不同的酶
Km
值不同,同一 种酶与不同底物反应
Km
值也
不同。
Km
值可近似的反应酶与底物的亲和力大小:
Km
值大,表明亲和 力小;
Km
值小,
表明亲和力大。测定
Km
值是酶学研究的一个重要 方法。大多数纯酶的
Km
值
在
0.01-0.00001mmol /L
。(
0.01
~
100mol/L
)
1
3.3
米氏方程:
V[S]
v =
Km + [S ]
v
:
反应初速度
(微摩尔浓度变化
/min)
V
:
最大反应速度
(微摩尔浓度变化
/min)
[S]
:
底物浓度
(
mol/L)
Km
:
米氏常数
(
mol/L)
此方程表明,当已知
Km
及
V
时,酶反应速度与底物浓度
之间的定量关系。
3.4
双倒数作图法测定
Km
值:
1
Km
1
1
v
V
[
S
]
V
1 /v
对
1/[S]
作图可得一条曲线,其斜率为
Km/Vmax
,截 距为
1/Vmax
。若将直线延
长与横轴相交,则该交点在数值上等于
-1 /Vmax
。
本实验采用最适
pH
、最适温度下,测定不同浓度时 酶活性。再根据林贝法作图求出
Km
值。
3.5
纤维 素酶水解纤维素产生的纤维二糖、葡萄糖等还原糖能将碱性条件下的
3
,
5-
二
硝基水杨酸(
DNS
)还原,生成棕红色的氨基化合物,在
540nm波长处有最大光吸收,
在一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度呈比例关系,利用比色法测定其 还原糖生
成的量就可测定纤维素酶的活力。
2
4
、实验方法步骤、操作流程及注意事项:
4 .1
实验方法与步骤:
1
、将预先准备好的
200
倍纤维素酶 液酶准确稀释到
10000
倍待用。
2
、每个底物浓度取三支
250
ml
试管,一直空白,两只对照,待用。
3
、预热:
参照下表:
表一
纤维素酶
Km
值的测定各管中底物液、缓冲液和酶液的用量
ml
CMC-Na
溶液
(
10 mg/ml
)
pH4.8
柠檬酸钠缓冲液
酶液
最终
CMC- Na
浓度
(
g/ml
)
0.2
1.8
0.5
1
0.4
1.6
0.5
2
0.6
1.4
0.5
3
0.8
1.2
0.5
4
1.0
1.0
0.5
5
1.2
0.8
0.5
6
1.4
0.6
0.5
7
1.6
0.4
0.5
8
1.8
0.2
0.5
9
2.0
0.0
0.5
10
注:
DNS
与定容用的蒸馏水分别为:
3 ml
,
19.5 ml
。
(
1
)
按上述配制方 法分别将
不同浓度
底物
2
ml
底物
(
mg/ml< br>)
和稀释到
10000
倍纤维素
酶液于
50
℃
水浴中保温
10min
。
(
2
)准确计时后,将保温后的酶液各取
0.5
ml
迅速加入保温后的不同浓度底物溶液
中,振荡混匀,并立即用秒表计时,在
50
℃
水浴中继续保温
30 min
。
3
、测定步骤
(
1
)
反应混合物物保温
30min
后,
于各个浓度底物试管中加入
3mLDNS
试剂终止
液,迅速振荡均匀。
(
2
)于不同底物浓度的空白对照试管中加入
0.5
ml
的酶液。
(
2
)将各底物浓度的三支试管沸水浴
5min
,自来水冷却后,加蒸馏水
19.5mL
。摇
匀,在
540nm处读取
OD
值。
4
、作图分析:
以
1/v
对
1/[S]
作一条曲线,求截距为
1/Vmax
。
注:本实验在纤维素酶最适反应条件
50
℃、
pH 4.8
下测定不同底物浓度的纤维素酶
3
km
值。
4.2
操作流程:
A
稀释
:
原酶液
底物
↘
↙
B
预热
:
各预热
10min
↙
↘
C
取液
:
稀释到
10000
倍的纤维素酶液
0.5mL
2mL
不同浓度的底物溶液
↓
D
反应
50
℃
水浴中保温
30min
↓
F
测定
①
3mLDNS
反应终止
→
②
沸水浴
5min
→
③定容至
25ml
→
④测定
OD540
吸光值
G
作双倒数图求
Km
4.3
实验注意事项
本实验是一个 定量测定方法,为获得准确的实验结果,应尽量减少实验操作中带来
的误差。底物溶液时应用同一母液进 行稀释,保证底物浓度的准确性。严格控制准确
的酶促反应时间。
①
反应温度准确,酶液准确稀释。不同
pH
所用酶液用对应
pH
缓冲液稀释
②试管上编号:贴上用圆珠笔写上编号的胶布,以防止保温或沸水加热时脱落;
③移液管使用时量取精准,保证结果可靠准确。
④精确记时:每一管加入酶液的时间要做记录,每管之间间隔的时间要合理;
⑤避免试管进水:煮沸和用流水冲洗时;
5
、实验结果与数据处理:
4
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