北京治疗癫痫病的专科医院-
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胎儿染色体非整倍体（
T21
、
T18
、
T13
）
检测试剂盒（高通量测序法）注册技术
审查指导原则
本指导原则 旨在指导注册申请人对胎儿染色体非整倍体
（
T21
、
T18
、T13
）检测试剂盒（高通量测序法）注册申报资料
的准备及撰写，
同时也为技术 审评部门对注册申报资料的技术审
评提供参考。
本指导原则是针对该类试剂的一般要 求，
申请人应依据产品
的具体特性确定其中内容是否适用，
若不适用，
需具体 阐述理由
及相应的科学依据，
并依据产品的具体特性对注册申报资料的内
容进行充实和 细化。
本指导原则是对申请人和审查人员的指导性文件，
但不包括
注册审批 所涉及的行政事项，
亦不作为法规强制执行，
如果有能
够满足相关法规要求的其他方法 ，
也可以采用，
但需要详细阐明
理由，
并对其科学合理性进行验证，
提供详细的研究资料和验证
资料，相关人员应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。
本指导原则是在现行法规和标准体系以及当前认知水平下
制定的，
随着法规和标准的不断完 善，
以及科学技术的不断发展，
本指导原则相关内容也将适时进行调整。
一、范围
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胎儿染色体非整倍体（
Fetal
Chromosome Aneuploidie s
）中
的
21
三体、
18
三体、
13
三体 （
Trisomies
21
、
Trisomies
18
、
Trisomies13
，即
T21
、
T18
、
T13
）是临床上最常见的染色体非整
倍体疾病。其对应的分别为
21-
三体 综合征（又称唐氏综合征，
先天愚型或
Down
综合征）
、
18-< br>三体综合征（又称
Edwards
综合
征）
和
13-
三体综合征
（又称
Patau
综合征）
，
发病率分别约为
1 /700
、
1/6000
、
1/10000
，患儿绝大多数存在严重 智力障碍及器官畸形。
产前筛查和产前诊断是为避免产生遗传缺陷患儿提供的手
段。
常规的产前筛查方法包括：
早孕期的超声与血清学联合筛查
和中孕期母体血清学筛查。
筛查结果为高风险的孕妇经建议经产
前诊断进行最终确认，
由孕妇知情选择。
胎儿染色体异常的产前
诊断金标准为介入前产前诊断手术
,
是指通过绒毛取材术
/
羊膜腔
穿刺术
/
经皮脐血管穿刺术，取相应细胞采用细胞生物学方法对< br>胎儿染色体进行核型分析。
高通量测序方法检测胎儿染色体非整倍体的原理是：
孕妇母
体血浆中存在胎儿游离
DNA
（
cell-free DNA
，
cfDNA
）
，长度约
为
75bp
—
250b p
，几乎全部来源于胎盘的滋养层细胞，其浓度和
孕周密切相关并以一定比例（
5%< br>—
30%
）稳定存在于母体外周
血浆中。
高通量测序方法通过取母体血 浆提取包含正常母体和胎
儿的血浆游离
DNA
，经文库构建，片段扩增等，最后进行上 机
测序，通过软件分析数据获得染色体数目评价结果。以检测
21
2
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三体综合征为例，
当对怀有
T21
胎儿的母体血浆游离
DNA
数据
进行分析时，
其
21
号染 色体游离
DNA
总数会有小比例的升高，
通过统计学算法区分这一微小差异来实现利用
cfDNA
进行胎儿
染色体非整倍体的产前筛查。
但高通量测序法不能对染色 体结构
异常进行检测，
不能代替传统筛查中的开放式神经管缺陷筛查等。
本 指导原则所述的胎儿染色体非整倍体（
T21
、
T18
、
T13）
检测试剂盒
（高通量测序法）
是指通过高通量测序法检测孕妇外
周血血 浆中胎儿游离脱氧核糖核酸（
DNA
）
，通过分析样本中的
胎儿游离
DNA
的
21
号、
18
号及
13
号染色体数量的差 异，
预期
用于对胎儿染色体非整倍体疾病
21-
三体综合征、
18-
三体综合征
和
13-
三体综合征进行产前筛查的检测试剂盒。
本指导原则所述的高通量测序法，是指通过文库构建、片段
扩增进而进行上机测序的第二代测序方法 ，
不需要进行片段扩增
的第三代、
第四代单分子测序方法在文中并未涉及。
但 高通量测
序技术发展迅速，
第三代、
第四代单分子测序方法在企业内部参
考品 设置、
性能评估或临床评价等处如有适用的方面，
可以参照
执行。
本指导原则所述检测试剂盒的适用人群为：对孕周为
12+0
周及以上的孕妇进行产前筛查，< br>其结果不能代表对孕妇怀有三体
胎儿的确认，产前筛查的结果必须要经过产前诊断进行确认。
伦理学原则应遵守国家相关法律法规及行业规定
。
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二、注册申报资料要求
（一）综述资料
综述资料主要包括产品预期用途、
产品描述、
有关 生物安全
性的说明、有关产品主要研究结果的总结和评价以及其他内容。
其中，
其他内 容包括同类产品在国内外批准上市的情况，
应着重
从方法学及检出限等方面写明拟申报产品与目 前市场上已获批
准的同类产品之间的主要区别。
综述资料应符合
《体外诊断试剂
注册管理办法》
（国家食品药品监督管理总局令第
5
号，以下简
称《办法》
）和《关于公布体外诊断试剂注册申报资料要求和批
准证明文件格式的公告》
（国家食 品药品监督管理总局公告
2014
年第
44
号，以下简称“公告”
） 的相关要求。
综述资料应详细阐明检测原理，
可配合图示并写明一个完整
检 测配合使用的全部试剂及耗材名称、
生产厂家、
货号或注册证
书号以及详细的组成成分 。
（二）主要原材料的研究资料
主要原材料的研究资料包括企业内部参考品和完成检测所
需试剂组成两部分。
1.
企业内部参考品应至少包括：阳性参考品、阴性参考品、
检测限参考品、嵌合体参考品， 具体要求如下：
1.1
阳性参考品：应采用
T21
、
T1 8
、
T13
胎儿
DNA
片段按
一定比例与正常女性血浆混合 的模拟样本。
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1. 2
阴性参考品：应包括采用染色体数目正常胎儿
DNA
片
段按一定比例与正常 女性血浆混合的模拟样本，
以及采用其他染
色体异常胎儿
DNA
片段按一定比 例与正常女性血浆混合的模拟
样本。
其他染色体异常的阴性参考品由申请人依据常见染色体异< br>常项目并根据对产品的质控要求自行选择。
1.3
检测限参考品：应采用T21
、
T18
、
T13
胎儿
DNA
片段按不同比例梯度与正常女性血浆混合的模拟样本，
如
5%
、
3.5%、
2.5%
等，建议采用
95%
（
n
≥
20< br>）的阳性检出率作为最低检测限
确定的标准。
1.4
嵌合体参考品： 由申请人按照对产品的质控要求自行设
定模拟
T21
、
T18
和T13
嵌合体的组成比例，如
70%
异常，
30%
正常；
30%
异常，
70%
正常等。
T21
、
T18
、
T13
及其他染色体异常胎儿
DNA
片段可由流产
组织或 羊水细胞、细胞系等来源制备。
申请人应详细说明企业内部参考品的组成、
详细说明 制备及
检定方法、
胎儿
DNA
片段浓度确认方式和所占比例的选择依据。组成各项企业内部参考品的样本应为不同来源。
2.
完成全部检测流程所需试剂 一般应至少包括：血浆游离
DNA
提取纯化试剂、
文库构建试剂、
文库定量试 剂、
测序试剂、
阴性质控品、
阳性质控品以及与之配合使用的测序芯片和数据分
析软件。具体要求如下：
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2.1
血浆游离
DNA
提取纯化试剂：无论申报产品中是否包
含，< br>申请人均应提交配合使用的提取纯化试剂的原理、
详细组成
成分、
生产厂家、< br>货号及第一类医疗器械备案凭证编号的相关资
料。性能方面需对该试剂提取的
DNA片段长度范围准确性及纯
度要求，提取效率、重复性及抗干扰能力进行评估。
2 .2
文库构建试剂、文库定量试剂、测序试剂：文库构建试
剂对片段化的
DNA
进行缺口补平及相应部分
5’
端磷酸化
（如需）
和
3’
端 去磷酸化（如需）
，之后使用连接酶加上用于测序和分析
的标签和接头，
构建成可以用 来测序上机的标准文库；
文库定量
试剂通过
PCR
扩增及与标准品曲线的比对 ，用于定量测定文库
浓度，
为后续均一化文库进行上机测序做准备，
同时能够评估文< br>库构建的质量。
文库定量时应明确对文库质量、
片段大小及浓度
要求，应提供分 析图谱，对其中参数进行解释说明（如是否有杂
峰，产生的原因，是否对最终结果产生影响等）
。文库定量不限
于上述方法，也可采用其他方法进行，如荧光染料法、
Qubit
定< br>量等；
测序试剂用于对均一化的文库进行片段扩增，
通过基因测
序仪捕捉扩增过 程中碱基的变化引起的信号变化来达到读取序
列的目的。
以上三种试剂一般由：相应 功能的酶（末端修复酶、
DNA
连接酶、缺口修复酶
DNA
聚合酶等）
、核苷酸序列（引物、接
头序列、标签序列、文库定量标准品）
、缓冲液及
dNTP
组成。
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具体要求如下：
，所选择的酶应当具有末端突出削平、缺口补平、标签或接
头连接、
DNA
聚合酶活性。
，序列准确度；引物设计应提交引物设计原则及选择对比依
据。
2.2.4 dNTP
：包括
dATP
、
dGTP
、
dCTP
、
dTTP
，应提交对纯
度、浓度等的详细验证资料。
2.3
阴、阳性质控品：须能够监控
DNA
片段提取到最终测
序结果全过程，因此应当由阴 、阳性（
T21
、
T18
和
T13
）胎儿
DNA< br>片段按已知比例与正常女性血浆基质混合组成。
2.4
测序芯片：
应 详细阐明芯片进行片段扩增的原理及结构，
明确使用芯片型号，
并对同一次测序芯片上样的样本 间精密度进
行评价。
2.5
数据分析软件：举例介绍原始数据质量评估、数 据处理
和筛选的方法，明确数据筛选依据以及使用的算法。
2.6
提交不同 原材料对于最终测序数据质量影响的评估材料。
由于各测序平台的技术侧重点不同，
数据质量评 估的项目可能存
在差异，需考虑包括但不限于以下方面：文库浓度、
文库片段大
小、< br>单样本总序列数
（数据量）
、
唯一比对率、
单次检测的
GC gap
（最高
GC
值与最低
GC
值的差值）等。
2.7
除上述资料，申请人还应提交主要原材料的筛选依据及
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试验资料。如为自制，则应提交：制备方法、质量要求、质量检
测方法、对比筛选的试验资料等；如为外购，则应提交：外购证
书、质量要求、质量检测方法、对比筛选 的试验资料等。其中，
对比筛选的试验资料应包括筛选过程中的数据、
图谱、
对比图表
等信息。
（三）主要生产工艺及反应体系的研究资料
1.
主要生产工艺包括配制工作液、
半成品检定、
分装和包装。
配制工作液的各种原材料 及其配比应符合要求，
原材料应混合均
匀，
配制过程应对关键参数进行有效控制。所提交申报资料中应
包括主要生产工艺介绍和生产工艺流程图，
后者需标明关键工艺
质控步骤，并详细说明该步骤的质控方法及质控标准。
2.
反应体系研究指完成检 测所涉及到的最佳反应条件的选
择确定过程，
包括对提取纯化步骤、
游离
DN A
片段的末端修复、
接头及标签连接、文库定量、
片段扩增、测序反应的反应条件及< br>反应体系的选择确定，
涉及到对样本类型、
样本用量、
试剂用量、
缓冲 体系的选择、
反应温度和时间条件及检测过程中质控方法确
定的依据。重点关注：酶浓度、引物 浓度、
dNTP
浓度、离子浓
度、加样量及反应体积、片段扩增各阶段温度、时间及循 环数、
测序数据质量的评估指标等，
其中加样量和反应体积应参考相应
行业标准，经研 究验证后确定。
此外，还应对数据量及胎儿游离
DNA
浓度和比例对检测结
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果的影响进行研究。
（四）分析性能评估资料
申请人应提交产品在产品研制或成品验证阶段对试剂盒进< br>行的全部性能的评估资料，
对于每项分析性能的评价都应包括研
究目的、实验设计、研究 方法、可接受标准、实验数据、统计方
法等详细资料。
有关分析性能评估的背景信息也应在申报 资料中
有所体现，包括实验地点（实验室）
、人员及数量、适用仪器、
试剂规格、批号 、临床样本来源（如涉及）等。分析性能评估的
实验方法可以参考相关的美国临床实验室标准化协会批准 指南
（
CLSI-EP
）文件或国内有关体外诊断产品性能评估的指导原则
进 行。建议着重对以下分析性能进行研究：
1.
最低检出限：建议使用企业参考品进行 梯度稀释并多次检
测，将具有
95%
阳性检出率的胎儿游离
DNA
浓 度水平作为最低
检出限。
企业参考品应使用公认的准确定量方法进行，
最低检出
限应描述为
XX DNA
浓度下可检出胎儿
DNA
的最小百分比。
2.
企业内部参考品符合率：对试剂检测企业内部参考品的符
合情况进行评估。
3.
精密度：精密度的评价方法并无统一的标准可依，可根据
不同产品特征或企业 的研究习惯进行，
前提是必须保证研究的科
学合理性，
具体实验方法可以参考相关的美 国临床实验室标准化
协会批准指南（
CLSI-EP
）或国内有关体外诊断产品性能评 估的
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指导原则进行。
企业应对每项精密度指标的评价标准做出合理要
求，
如标准差或变异系数的范围等。
针 对本类产品的精密度评价
主要包括以下要求：
3.1
对可能影响检测精密度 的主要变量进行验证，除检测试
剂（包括核酸分离
/
纯化组分）本身的影响外，应对高 通量基因
测序仪、操作者、地点、
合理的精密度评价周期等要素进行相关
的验证。
例如：
为期至少
XX
天的连续检测，
每天至少由
2< br>人完成不
少于
2
次的完整检测，从而对批内
/
批间、日内/
日间以及不同操
作者之间的精密度进行综合评价。
申请人还应选择不同的实验室
进行重复实验以对室间精密度进行评价。
3.2
用于精密度评价的模拟样品 和临床样本均应至少包含
3
个水平：阴性样品、临界阳性样品、
（中或强）阳性样品， 并根
据产品特性设定适当的精密度要求。
精密度评价中的每一次检测
均应从核酸提取开 始。
4.
干扰试验：包括内源性干扰物质和外源性干扰物质。应针
对可能存 在的干扰情况进行验证。
建议申请人在干扰物质的潜在
最大浓度
(
即“最差条 件”
)
条件下进行评价。内源性干扰物质的
评价至少应包括胆红素、游离血红蛋白、甘 油三酯。
5.
特异性：
对以下是否干扰
T21
、
T18
、
T13
阴阳性的检出能
力进行评价：
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5.1
微缺失、
微重复评价：
申请人应采用一定比例的微缺失、
微重复胎儿
DNA
与正常女性血浆混合制备 微缺失、微重复模拟
样本进行评价。
5.2
嵌合体评价：申请人应采用不同 嵌合比例的模拟
T21
、
T18
和
T13
嵌合体样本对试剂 检测嵌合体的能力进行评估，
对不
能检测到的模拟嵌合体的嵌合比例进行确认。
5.3
对其他常见染色体样本的干扰进行评价。
微缺失微重复模拟样本、< br>嵌合体模拟样本及其他常见染色体
样本的类型和数量由申请人选择确定，并在产品说明书中明确。
（五）阳性判断值的确定资料
由于目前胎儿染色体非整倍体
T1 3
、
T18
、
T21
的阳性判断
值存在多种计算方式，且更好的算法和数据处理方式仍在不断开
发中。
因此，
如申请人选择了某一算法作 为阳性判断值的计算方
式，
则应详细阐述选择该算法作为阳性判断值依据的原因
（如权
威文献、行业共识等）
，并详细阐述计算公式和各参数代表的意
义。
以大样本量常用的
Z-
值（
Z-score
）算法来举例说明：
1.Z-
值这个统计量反应的是当前数值距离平均数的相对标
准距离，
Z-< br>值的应用条件为大样本量以及数据符合正态分布，
计
算公式如下：
1.1chrN z-score for test sample:
所检测样本的
Z-
值；
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1.2 N
：指定的第
N
染色体；
1.3%chrN
sample
：待测样品第
N
条染色体唯一比对序列数占
常染色体的百分比，通过高通量测 序后软件分析获得；
1.4 Mean%chrN
reference
：< br>参照样品第
N
条染色体比例平均值；
条染色体比例的标准偏差。
该公式中，影响唯一比对序列的因素包括
GC< br>含量、检验覆
盖度等，
申请人应计算并统计检验覆盖度是否在正常范围内。
参< br>照
样
品
的
数
量
、
来
源
等< br>均
对
其
数
据
产
生
影
响
，< br>进
而
影
响
Mean%chrN
reference
和
S.D.%chrN
reference
。
因此，
申请人需对参照样
品的数据计算进行详述，并提供计算值。
2.
被筛查孕妇所怀胎儿的染色体 数量状况符合正态分布，
即
大概率为正常染色体数量，小概率事件为胎儿染色体非整倍体，如图
1
所示：
图
1
正态分布图
如图
1
可以看出，出现在
Z-
值为正负
3
以外的数值，则有
99.9%
的可能为阳性，
因此，
通常将
Z-
值
= 3
定为阳性判断值分界
点，
Z-
值
>3
或
Z-值
<-3
判断为胎儿染色体非整倍体阳性。
申请
人应当根据试 验对
Z-
值
>3
及
Z-
值
<-3
的情况分 别进行说明。
鉴于并无
100%
阴阳性分界点，一般来说，申请人应设定阳
性判断值灰区范围，
灰区的设定应提交理论和实际试验结果的依
据，并在说明书【阳性 判断值】和【检验结果的解释】项进行解
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释说明，如：
是否需要用产前诊断的方式进行最终确认，可能的
原因，
是 否需要孕龄再大时进行再次抽血复测等等。
如无灰区设
置，也应提交理论和大样本量试验结果的 依据。
在阳性判断值设定后，
申请人应当选取一定数量阴、
阳性真
实临床样本进行试验验证，
如与该公式不符，
则应说明出现的问
题及详细的数据校正方 式。
（六）稳定性研究资料
稳定性研究资料应包括研究方法的确定依据、
具体的实施方
案、详细的研究数据以及结论。
主要涉及两部分内容，申报产品
的稳定性和适用样本的稳定性研究。
1.
申报产品的稳定性研究主要包括实时稳定性 （有效期）
、
运输稳定性、
开瓶稳定性及冻融次数限制等研究。
对于实时稳定
性研究，
应提供至少三批样品在实际储存条件下保存至成品有效
期后的研究资料。
2.
适用样本的稳定性研究主要包括对含有游离
DNA
的孕妇
血浆的保存、冷藏和冷冻条件下的有效期验证以及血浆游离
DNA
提取后储存条件的验证。可以 在合理的温度范围内选择温
度点（温度范围）
，每间隔一定的时间段对储存样本进行检测，从而确认样本的稳定性。
适于冷冻保存的样本还应对冻融次数进
行评价。
应注意运输稳定性、
开瓶稳定性等研究实际上均指经运输或
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