幼儿园教师寄语-
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PCR
常见问题分析及对策
(
无扩增产物、非特 异性扩增、拖尾、假阳性
)
问题
1
:无扩增产物
现象:正对照有条带,而样品则无
原因
:
1.
模板
:
含有抑制物,含量低
对样品不合适
3.
引物设计不当或者发生降解
4.
反应条件:退火温度太高,延伸时间太短
对策
:
1.
纯化模板或者使用试剂盒提取模板
DNA
或加大模板的用量
2.
更换
Buffer
或调整浓度
3.
重新设计引物(避免链间二聚体和链内二级结构)或者换一管新引物
4.
降低退火温度、延长延伸时间
问题
2
:非特异性扩增
现象:条带与预计的大小不一致或者非特异性扩增带
原因:
1.
引物特异性差
2.
模板或引物浓度过高
3.
酶量过多
2+
浓度偏高
5.
退火温度偏低
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6.
循环次数过多
对策:
1.
重新设计引物或者使用巢式
PCR
2.
适当降低模板或引物浓度
3.
适当减少酶量
4.
降低镁离子浓度
5.
适当提高退火温度或使用二阶段温度法
6.
减少循环次数
问题
3
:拖尾
现象:产物在凝胶上呈
Smear
状态。
原因:
1.
模板不纯
不合适
3.
退火温度偏低
4.
酶量过多
、
Mg
2+
浓度偏高
6.
循环次数过多
对策:
1.
纯化模板
2.
更换
Buffer
3.
适当提高退火温度
4.
适量用酶
5.
适当降低
dNTP
和镁离子的浓度
6.
减少循环次数
问题
4
:假阳性
现象:空白对照出现目的扩增产物
原因:
靶序列或扩增产物
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的交
*
污染
对策:
1.
操作时应小心轻柔,防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外;
2.
除酶及不能耐高温的物质外,所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管
及加样枪头等均应一次性使用。
3.
各种试剂最好先进行分装,然后低温贮存
PCR
产物的电泳检测时间
一般为
48h
以内,有些最好于当日电泳检测,大于
48h
后带型不规则甚致消失。
假阴性,不出现扩增条带
PCR
反应的关键环节有①模板核酸的制备,②引物的质量与特异性,③酶的质量及,
④
PCR
循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。
模板:①模板中含有杂蛋白质,②模板中含有
Taq
酶抑制剂,③模板中蛋白质没有消
化除净,特别是染色体中的组蛋白,④在提取制备模板时丢失过多,或
吸入酚。⑤模
板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时,不出现扩增带,极有可能是标本的消化处
理,模板核酸提取过程出了毛病,因而要配制有效而稳定
的消化处理液,其程序亦应
固定不宜随意更改。
酶失活:需更换新酶,或新旧两种酶同时使用,以分析是否因酶的活性丧失或不够而
导致假阴性。需注意的是有时忘加
Taq
酶或溴乙锭。
引物:引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称,是
PCR
失败或扩增条带不
理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题,两条引
物一条浓度
高,一条浓度低,造成低效率的不对称扩增,对策为:①选定一个好的引物合成单
位 。②引物的浓度不仅要看
OD
值,更要注重引物原液做琼脂糖
凝胶电泳,一定要有
引物条带出现,而且两引物带的亮度应大体一致,如一条引物有条带,一条引物无条
< br>带,此时做
PCR
有可能失败,应和引物合成单位协
商解决。如一条引物亮度高 ,一条
亮度低,在稀释引物时要平衡其浓度。③引物应高浓度小量分装保存,防止多次冻融
或长期放冰箱冷藏部分,导致引物变
质降解失效。④引物设计不合理,如引物长度不
够,引物之间形成二聚体等。
Mg2+
浓度:
Mg2+离子浓度对
PCR
扩增效率影响很大,
浓度过高可降低
PCR
扩 增的特
异性,
浓度过低则影响
PCR
扩增产量甚至使
PC R
扩增失败而不出扩增条带。
反应体积的改变:通常进行
PCR
扩增采用的体积为
20ul
、
30ul
、
50ul
。或
100ul
,应用多
大体积进行
PCR
扩增 ,是根据科研和临床检测不同目的而设定,在
做小体积如
20ul
后,再做大体积时,一定要模索条件,否则容易失败。
物理原因 :变性对
PCR
扩增来说相当重要,如变性温度低,变性时间短,极有可能出
现假阴性
;
退火温度过低,可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退
火温度过高影
响引物与模板的结合而降低
PCR
扩增效率。有时还有必要用标准的温度计 ,检测一下
扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度,这也是
PCR
失败的原因之一。
靶序列变异:如靶序列发生突变或缺失,影响引物与模板特异性结合,或因靶序列某
段缺失使引物与模板失去互补序列,其
PCR
扩增是不会成功的。
假阳性
出现的
PCR
扩增条带与目 的靶序列条带一致,有时其条带更整齐,亮度更高。
引物设计不合适:选 择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性,因而在进行
PCR
扩增
时,扩增 出的
PCR
产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短,容
易出现假阳
性。需重新设计引物。
靶序列或扩增产物的交叉污染:这种污染有两种原因:一是整个基因组或大片段的交
叉污染,导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决:①操作时应小心
轻柔,防止
将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。②除酶及不能耐高温的物质外,所有试剂或
器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使
用。③必要时,
在加标本
前,反应管和试剂用紫外线照射,以破坏存在的核酸。
二是空气中的小片段核酸污
< br>染,
这些小片段比靶序列短,但有一定的同源性。
可互相拼接,与引物互补后,可扩
增出
PCR
产物,而导致假阳性的产生,可用巢式
PCR
方法 来减轻或消除。
出现非特异性扩增带
PCR
扩增后出现的条带与预计的大小不一致,或大或小,或者同时出现特异性扩增带
与非特异性扩增带。非特异性条带的出现,其原因:一是引物与靶序列
不完全互补、
或引物聚合形成二聚体。二是
Mg2+
离子浓度过高、退火温度过低,及
PC R
循环次数
过多有关。其次是酶的质和量,往往一些来源的酶易出现非
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特异条带而另一来源的酶
则不出现,酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有:①必要时重新设计引
物。②减低酶量或调换另一来源的酶。③降低引
物量,适当增加模板量,减少循环次
数。④适当提高退火温度或采用二温度点法
(93
℃变性,
65
℃左 右退火与延伸
)
。
出现片状拖带或涂抹带
PCR
扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。
其原因往往由于酶量过多或酶的质量
差,
dNTP
浓度过高,
Mg2+
浓度过高,
退火温度过低 ,
循环次数过多引起。
其对策有:①减少酶量,或调换另一来源的酶。②减少
dNTP
的浓度。③适当降低
Mg2+
浓
度。④增加模板量,减少循环次数。
克隆
PCR
产物的最优条件是什么?
最佳插入片 段:载体比需实验确定。
1
:
1
(插入片段:载体)常为最佳比,摩尔数比< br>1
:
8
或
8
:
1
也行。应测定比值范围。连 接用
5ul 2X
连接液
, 50ng
质
粒
DNA,1We iss
单位的
T4
连接酶,插入片段共
10ul
。室温保温
1
小时,或
4oC
过夜。在这
2
种温度下,缺
T-
凸出端的载体会自连,产生蓝斑。室温保温
1
小时
能满足大多数克隆要求,为提高连接 效率,需
4oC
过夜。
PCR
产物是否需要用凝胶纯化?
如凝胶分析扩增产物只 有一条带,不需要用凝胶纯化。如可见其他杂带,可能是积累了大量引物的二聚体。少量的引物二聚体的摩尔数也 很高,这会产生高
比例的带有引物二聚体的克隆,而非目的插入片段。为此需在克隆前做凝胶纯化。
如果没有回收到目的片段,还需要作什么对照实验?
A
)涂布未转化的感受态细胞。如有菌落,表明氨苄失效,或污染上带有氨苄抗型的质粒,或产生氨苄抗型 的菌落。
B
)转化完整质粒,计算菌落生长数,测定转化效率。例如,将1ug/ul
质粒
1:100
稀释
,1ul
用于
100 ul
感受态细胞转化。用
SOC
稀释到
1000ul
后,用
100ul
铺板。培养过夜,产生
1000
个菌落。转化率为:
产 生菌落的总数
/
铺板
DNA
的总量。铺板
DNA
的总量是转 化反应所用的量除以稀释倍数。具体而言转化用
10ng
DNA
,用
SOC
稀释到
1000u
后含
10 ng DNA
,用
1/10
铺板,共用
1 ng DNA
。转化率为 :
1000
克隆
X10
(
3
次方)
ng /
铺板
1 ng DNA ug=10
(
6
次方)
cfu/ ug
转化
pGEM-T
应用
10
(
8
次方)
cfu/ ug
感受态细胞如没有菌落或少有菌落,感受态细胞的转化率太低。
C
)如用
pGEM-T
正对照,或
PCR
产物,产生
>20 -40
蓝斑(用指定步骤
10
(
8
次方)
cfu/ ug
感受态细胞),表明载体失去
T
。可能是连接酶污染了核酸酶。
T4 D NA
连接酶(
M1801
,
M1804
,
M1794
)质量标准好无核酸酶污染,不应用其它来源的
T4 DNA
连接酶替换。
D
)用
pGEM-T
或
pGEM-T
Easy
载体,连接
pGEM-T
正对照,转化高频率感受态细胞(
10
(
8
次方)
cfu/ug
)
,
按照指定的实验步骤,可得
10 0
个菌落,其中
60%
应为白斑,如产生
>20-40
蓝斑
,
没有菌落或少有菌落,连接有问题。
对照实验结果好,却没有回收到目的片段,实验出了什么问题?
A
)连接用室温保温
1
小时,能满足大多数克隆,为提高效率,需
4oC
过夜。
B
)插入片段带有污染,使
3`-T
缺失,或抑制连接, 抑制转化。为此,将插入片段和
pGEM-T
正对照混合,再连接。如降低了对照的菌落数,插 入片段需纯
化,或重新制备。如产生大量的蓝斑,插入片段污染有核酸酶,使
pGEM-T或
pGEM-T Easy
载体
3`-T
缺失。
C
)插入片段不适于连接。用凝胶纯化的插入片段,因受
UV
过度照射,时有发生。< br>UV
过度照射会产生嘧啶二聚体,不利于连接,
DNA
必需重新纯化。
D
)带有修复功能的耐热
DNA
聚合酶的扩增产物末端无
A< br>,后者是
pGEM-T
或
pGEM-T Easy
载体克隆所需。加
Taq DNA
聚合酶和核苷酸可在末端加
A
。详情查
pGEM-T pGEM-T Easy
载体技术资料(
TM042
)。
E
)高度重复序列可能会不稳定,在扩增中产生缺失和重排,如发现插入片段高频率地产生缺失和重排,需用重组缺 陷大肠杆菌菌株,如
SURE
细胞
PCR
疑难解答
当
PCR
结果不甚满意时,首先检查以下几方面并遵照执行:
将
PCR
反应的试管与反应板紧贴。
当酶反应混合物以
70
℃“热启动”开始循环时,切记在加入酶后稍微振荡一下,因为在
0.2-ml
的
PCR
管中不能均匀传热。
不要随意减少
dNTP
的用 量,它是一个系统的因素,必须与其它成份保持平衡。
对于有问题的
PCR
反应,例如模板的量少,模板不纯和环状模板等,先尝试加
Taq
酶前的体系进行预变性,后 加模板进行正常
PCR
扩增。
没有扩增产物:
在提 供
MgCl2
缓冲液中,以
0.25mmol/L
为梯度增加
MgC l2
浓度;无
MgCl2
的缓冲液以
0.5 mmol/L
为梯度增加
MgCl2
浓度。
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泳道中出现模糊条带,如果
DNA
模板中存在
R NA
,则按上述提示浓度补加
MgCl2
,因为在
PCR
反应中可能 缺少游离的
Mg2+
。
检查退火温度和变性条件,如果有需要的话,可降低退火温度。
检查模板和引物的用量。
增加循环次数和
/
或模板
DNA
的用量。
泳道中出现模糊条带:
减少循环次数或模板
DNA
的用量。
提高退火温度,但不要超过
68
℃。
重新设计引物或设计更长的引物。
其他值得注意的条件:
建 议使用
0.2-ml
薄壁管。厚壁管在
92
℃时不能有效地使模板变性。
最佳反应体积为
50ml
,推荐用
30ml
矿物油覆盖(对 盖子加热的
PCR
仪可以不加)
。
大多数反应中,
0. 75ml
(
0.5~1ml
)的酶量在大多数情况下可以得到满意的结果。
建议使用
1.75mmol/L MgCl2
∶
350mmol/L dNTP
或
2.25mmol/L MgCl2
∶
500mmol/L dN TP
组合的混合物。然而要得到最佳结果,优化
Mg2+
的浓度是必需的。
基因组
DNA
模板的质量显著影响
PCR
反应。
因此推荐使 用琼脂糖凝胶电泳来检测
DNA
的长度。
DNA
片段长度可以超过
5 0kb
,
传统的基因组
DNA
能扩增片段至
10kb
。
要扩增更长的片段应使用超纯或高分子量的
DNA
。请查阅高分子量
DNA
提取操作过程相关文献。
降低二级结构和引物二聚物形成的可能性。进行长 片段
PCR
扩增时,引物长度一般为
24~34
个核苷酸,溶点在
6 0~68
℃间。使用这类引物可提高
PCR
反应的退
火温度来增加反应的特异 性。这点非常重要,长片段扩增的效果往往受到非特异性短片段优先扩增的影响。
变性:第 一步变性在
94
℃下进行
2
分钟。在循环过程中尽可能缩短变性时间(
94
℃下进行
20--30
秒)
,除非模板中富含
GC
, 则
95
℃下变性
30
秒。这可以防止
DNA
脱嘌啉和链断裂 ,对于所需扩增的基因组
DNA
片段终长度超过
12 kb
时,应该尽可能的降低变性温度。
延伸:
68-- 72
℃下进行延伸操作。
循环延伸:尽量采用循环延伸的条件,若
PCR
仪无此功能,则必须增加延伸的时间,例如在扩增
10kb
片断时,延伸时间用
10
分钟替代原来的
8
分钟。
长片断
PCR
系统扩增的片断其
3
’
-
末端带有一个突出的
A
,因此建议 采用
T/A
克隆。若要进行平端可隆,可用
Klenow
酶和
T4 DNA
多聚酶将
PCR
产物补平后再
进行。
测序时因酶 的混合物带有
3
’→
5
’外切酶活性,用
Sanger
方法 进行测序不能产生均一的(染色体)带型。
引物设计:
一般长度
20-30bp
;
至少
50%
的
GC
含量;
避免引物二聚体和二级结构;
引物对的
Tm
值应该接近。
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也可下列图示提示找到解决问题的突破口:
PCR
实验操作程序
1.
在无菌的
0.5ml
或
0.2ml
离心管中按下列操作程序加样:
反应物
加样顺序
体积
(
μ
l)
终浓度
去离子水
1 29.4
10
×
Buffer B 2 5 1
×
4
×
dNTP
混合物
3 5
各
200
μ
mol/L
MgCl
2
4 3 1.5mmol/L
有义引物
5 2.6 0.25
μ
mol/L
反义引物
6 2.6 0.25
μ
mol/L
模板
7 2 0.1
μ
g
TaqDNA
聚合酶
8 0.4 1unit
2.
用微量可调加样器和一次性
Tip
向每一管中加
50
μ
l
矿物油。每加一管换一次
Tip
。
3.
振荡每只管,然后短暂离心。
4.
将管放到预热的热循环中,按下列程序开始循环:
预变性
94
℃
4
分钟
1
次
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本文更新与2021-01-25 15:43,由作者提供,不代表本网站立场,转载请注明出处:http://www.xapfxb.com/yuer/426613.html