免疫组化染色过程中存在的问题、原因分析及对策

2021年1月25日发(作者：雷从民)

免疫组化染色过程中存在的问题、原因分析及对策


良好的免疫组化染色切片是正确判断染色结果的基础和前提。
由于免疫组化染色过程 中存在
很多步骤或环节，
每一个步骤或环节都可能影响到染色的最终结果，
因此，要做好一张高质
量的免疫组化切片并不是一件非常容易的事。
需要病理技术员和病理医生密 切配合、
相互协
调、
共同努力才能保证做出合格的免疫组化切片。
虽然免疫组 化染色可以存在各种各样的问
题，但从染色的结果看，一般可分为两类：无色片（即无阳性信号）和“杂 音”染色片（有
阳性信号）。





一、

无色片





染色结 束后，
切片中见不到任何阳性信号。
这是常规工作中比较常见的现象，
出现
这 种现象，有两种可能：
1
、真阴性结果：整个染色过程没有出现问题，组织或细胞确实不
表达与抗体相关的抗原。
2
、假阴性结果：即此阴性结果不是真实的反映。假阴性结果又可< br>分为两种情况：（
1
）、切片中根本就不包含所预期检查的组织或细胞。出现这种情况， 要
麽是病理医生选择错了切片或抗体选错了，
要麽是技术员选错了蜡块。
获得正确的切 片进行
染色是获得正确结果的前提。由此表明：制作出合格的免疫组化切片不仅仅是技术员的事，
病理医生也起着不可缺少的作用。（
2
）、染色过程中的某一或某些环节出了问题。比如，< br>组织未进行抗原修复，
有的组织必须经过抗原修复才能检测抗原表达；
或选用了只能用于 冰
冻组织而不能用于石蜡包埋组织的抗体；
或一抗失效，
虽然抗体失效在理论上是一个 逐渐的
过程，但偶尔也遇到突然失效的情况，抗体长期不用和
/
或已超过有效期是主要 的原因。也
可见于染色过程中漏掉了某一环节，如忘记加二抗或三抗，或用了两次二抗而缺少了三抗，< br>或配制
DAB
时少了过氧化氢。
为了避免这种简单的错误，
有一种简单 的方法：
在三抗孵育结
束时，
将切片上的三抗甩在一张白纸上，
在将配制好的
DAB
滴一滴在白纸的三抗上，
观察是
否出现棕色。
如果出现了，< br>证明三抗和
DAB
的配制过程没有错误。
如果这种
DAB
再滴 到切片
上没有出现任何阳性信号，
问题一定是出在三抗以前。
如果纸上不出现棕色反应 ，
问题肯定
在三抗
DAB
或
DAB
的配制过程。这种简单方 法能迅速的帮助我们查找出现问题可能的原因。





解决阴性染色的问题非常简单，就是设立“阳性对照”。如果阳性对照有了表达，
说明染色的全过程和所 有试剂都没有问题。
如果此时测试片仍为阴性，
便是真实的阴性，
说
明组织或 细胞没有相应的抗原表达。
反之，
如果阳性对照没有着色，
表明染色过程中某个或某些步骤出了问题或试剂出了问题。
应一一寻找原因。
阳性对照包括两种，
一种称 为“自身
对照”或“内部对照”，
这是指在测试的切片中本身就存在已知的抗原，
如正 常淋巴结中存
在
T
和
B
细胞抗原，
CD20
或CD3
都应该有表达。自身对照是一种比较理想的对照，对照和
测试组织或细胞都在同一张 切片中，
都处于相同的试验条件下，
结果更可靠也更具有可比性。
在选择自身对照片时 最好选择既有病变组织同时又有正常组织的部分，
这样有利于对比。
另
一种称为“外部 对照”，
有时在测试的切片中不存在已知的抗原，
如在胃的标本中怀疑是恶
性黑色素瘤 ，需要用
HMB45
或
Mart-1
来检测，在正常的胃组织中本身不存在相 关的抗原，
如果病变出现阳性反应结果，
尚能提示是恶黑，
但是如果出现阴性结果，< br>就无法确定是本身
组织中不含黑色素瘤抗原，还是技术问题。因此，应另外设立一个已知的阳性对 照。
这种在
测试组织之外的阳性对照称为“外部对照”。在实际工作中需要设立外部对照的情况 很多，
如果每一种抗体都要选不同的阳性对照，
工作量会很大。
为了解决这个问题，< br>目前国内外有
单位将多种不同组织集成在一起，制成多组织切片、“腊肠”“春卷”切片、组织芯 片等，
其连续切片储备待用，需要时取出一张便可作为阳性对照。另外，
比较简单的方法，是采 用
阑尾作为阳性对照，
因为与人体其它组织器官比较阑尾包含的组织种类较多，
如有上 皮、
淋
巴组织、平滑肌、间质、神经、血管、间皮等。一张阑尾切片可以检测大多数常用的抗体 。





设立阳性对照是病理医生的任务或责任，而不 是技术员的责任。病理医生观察了
HE
切片，了解切片中是否有自身对照，如果没有，就应告诉 技术员采用阳性对照。因此，
病理医生在免疫组化中的作用是不可忽视的。

抗体未覆盖上测试组织：当多块散开的小组织染色时，可能漏掉某块组织染色。






二、“杂音”染色片






免疫组化除正常的真实的阳性信号外常常会遇到不正常的背景着色，< br>这些非正常
的着色称为“杂音”染色。
“杂音”染色种类繁多，
产生的原因也多 种多样，
为了便于说明，
笔者将其归纳为下面几种。





1
、

全片着色





全片着色是指整个切片全都染上了颜色，
着色的强度可深可浅，
总之，分不清那些
组织是阳性那些组织是阴性。出现这种现象的原因有：






（
1
）、抗体浓度过高：一抗浓度过高是常见的原因 之一。解决办法是，每次使用
新抗体前应当对其工作浓度进行测试，
使每一抗体个体化，
找到适合自己实验室的理想工作
浓度，既使是即用型的抗体也应如此，不能只简单的按说明书进行染色 。





（
2
）、抗体孵育时间过长 或温度较高：解决办法是，严格执行操作规程，最好随
身佩带报时表或报时钟，
及时提醒，避免因遗忘而造成时间延长。
现在流行的二步法
（
Polymer
）敏感性很高，要求一抗孵育的时间不是传统的
1
小时，而是
30
分钟，因 此，要根据染色结
果进行调整。





（3
）
、
DAB
变质和显色时间太长：
DAB
最好现用现 配，
如有沉渣应进行过滤后再用。
配制好的
DAB
不应存放时间太长，因为在 没有酶的情况下，过氧化氢也会游离出氧原子与
DAB
产生反应而降低
DAB
的效力，
未用完的
DAB
存放在冰箱里几天后再用这种似乎节约的办
法是不可 取的。
DAB
的显色最好在显微镜下监控，达到理想的染色程度时立即终止反应。不
过 当染色片太多时或用染色机时，
这样做似乎不现实，
但至少应对一些新的或少用的抗体显
色时进行监控，避免显色时间过长。





（
4
）、组织变干：修复液溢出后未及时补充液体、染色切片太多、动作太慢、忘
记滴液、滴液 流失等都是造成组织变干的原因。解决的办法是操作要认真仔细，采用
DAKO
笔或
P AP
Pen
在组织周围画圈，可以有效的避免液体流失，也能提高操作速度。





（
5
）、切片在缓冲液或修复液中浸泡时 间太长（大于
24
小时）：原因上不清楚，
但现象存在。有的实验室喜欢前一天将切片 脱蜡至修复，第二天加抗体进行免疫组化染色，
如果将装有切片和修复液的容器放在
4&ord m;C
冰箱过夜，对结果无明显影响，如果放在室
温，特别是炎热的夏天，会出现背景着色，因 此，不可存放时间太长。（
6
）、一抗变质、
质量差的多克隆抗体：
注意抗体 的有效期，
过期的抗体要麽不显色要麽背景着色。
用新买的
抗体时最好设立阳性对照和 用使用过的抗体作比较。





2
、

切片边缘着色