ELISA设置阴性、阳性、空白对照涉及实验结果有效性评价

2021年1月25日发(作者：邓叔群)
ELISA
设置阴性、阳性、空白对照涉及实验结果有效性评价


一．
ELISA
试验有效性与三项对照

什么是
“
有效性
”
（
Validity
）？要获得准确的检测结果
“
有效性
”
评价，就会关系到：为什么要设
置
“
阴性、
阳性和 空白
”
等不可缺少的三项对照？要用什么样的物质担当
“
阴性、
阳性 和空白对照
（品）
”
？这
“
三项对照
”
如何设置、
需要设置几个孔位？获得的测定值如何
“
认可、
取舍与计算
”
？
随后，又如何依照阳性对照均值（
PCx
）与阴性对照均值（
NCx）的差值（
P-N
，或
N-P
）大小
做出
“
试 验结果有效性
”
的最终裁决呢？
…
等等，这一连串的问题，在国外
“
正规
”
品牌的
ELISA
试剂
《使用说明书》
中都 有明细和详尽的说明。
既有理论要点提示，
又有具体细致的举例解说。
很可惜，在90
年前后，国内兴起
ELISA
检测热潮之际，在一片
“
国外 试剂说明书太详细、太复
杂、
不容易看明白、
…”
等等
“
一 片埋冤
”
声中，
正好迎合国内商家的
“
意愿
”
。< br>从此以后，
国产
ELISA
试剂的说明书，越来越简单。这其中商家就有两个< br>“
好处
”
：好处之一，用
A4
、或
B5
，甚 至比
B5
还要小的一张纸，代替国际试剂的好几页的
“
使用说明书
”
（等同于一份
“
操作手册
”
），每年
就可节省一大笔印刷成 本费；好处之二，如同国际试剂说明书上向用户交待的各种表明本试剂
质量有关的详尽内容，国产试剂的 所谓
“
说明书
”
上统统可以
“
删除、回避、拒绝
”
向用户通报和
承诺。我
90
年前后收集的
<
美
>< br>雅培、
<
法
>
巴斯德、
<
荷
>
阿克 苏等相关试剂的原文说明书，几
经搬动全都处理，很是可惜。近日，杭州检疫局朋友送了一份生物梅里埃 中国有限公司的中文
版《人类免疫缺陷病毒抗原抗体诊断试剂盒（酶联免疫法）使用说明书》。对照阅读 之下，深
深感到这才是一份真正意义上的《使用说明书》呀！在我下文提到的若干
“
概 念、问题
”
，从中
都可以找到答案。
我现在参照我本人
1993年的
《肝炎
ELISA
试剂质量与检测结果有效性评价》
会议讲稿相关内 容，就
“
三项对照与检测结果有效性
”
表示如下认识和讨论。

二．三项对照要求与用途

ELISA
检测，按照试剂说明书要求，每次试验 、每块扳上都要设置以下
3
项对照和用途：

1
．
空白对照
：
仅用稀释液代替检测样本、
用以观测最终反应的显色
“
本底
”
、
并用于酶标仪消除、
扣除
“
本底
”
，即：以 本底为
“
零
”
读取阳性、阴性对照孔和样本检测孔的吸光值（
A）；或者，在
计算阴性对照均值（
NCx
）、阳性对照均值（
PCx）、样本读数的
S/C.O.
值时减去空白对照的本
底吸光值。早年的酶标仪无自 动扣除空白对照孔读数功能，这种酶标议现已淘汰不用了，写上
这段话的意思是补充说明设置空白对照的 用途。
空白孔具体如何读取读数，
则依照说明书操作。
例如，生物梅里埃中国有限公司 的中文版《人类免疫缺陷病毒抗原抗体诊断试剂盒（酶联免疫
法）
使用说明书》
上提示 ：
以空气读空白
（不放板架和板条）
，
在
450nm
（单波 长）
、
或
450nm
和
620
—
700mn
（底物是
TMB
）参考波长进行读数。

2
．阴性对照
（品）：

（
1
）阴性对照（品）的 概念与要求：所谓阴性对照（品），应当是本项检测试验中采用与待捡
物（样品、人用试剂就是人的血清 等）具有同源性和同质性，又不含有待检物质，并能客观比
较和鉴别处理因素（血清免疫学试验中有特异 性抗原与抗体反应）之间的差异。因此，用动物
血清或其制品（如牛血清白蛋白等）代替阴性人血清作为 对照品，从理论和实践上都是不可取
的，弊端甚多，无须细述。注意：据我所知，国产
ELIS A
试剂中，有的厂牌是用动物血清制品
稀释配置、或与部分人血清混合配置的；其二，阴性对照 读数，并非是
“
越低越好
”
。
NCx
值接
近
0.00X
水平，这是假象！试想一下，真正采用
“
阴性人血清
”
的阴性对照品，
NCx
值会如此之
低吗？举个例子，
雅培乙肝六项
E IA
试剂的
NCx
值，
分别为：
0.010
（
HB sAg
）
、
0.027
（抗
—
HBs
）
、
0.035
（
HBeAg
）、
1.083
（抗
—< br>HBe
）、
1.065
（抗
—
HBc
）、
0 .045
（抗
HBc-IgM
）。生物梅里
埃的
HIV
试剂
NCx
是
0.091
。
辨别试剂
NCx
值是否合理 的一个很简单的方法，
只要对比大量阴
性样本的实际读数就
“
一目了然
”
啦！

一个题外插曲：表明
ELISA
试剂内在质量的一个重要 统计标志，就是要看：阴性样本的的上限
不应当大于、
必须小于
C.O.I.=1.0 0
；
反之，
阳性样本的的下限不可小于、
应当大于
C.O.I.=1 .00
！
早年我用
SPSS
软件输出阿克苏
HIV
和国产甲 、乙试剂检测
600
例左右的健康人体检血清的三
幅直方图（附图
3
—
1
），可以表明阴性样本的不同分布特征，颇有意思。


1
附图
3
—
1
我为什么要如此细说
NCx
呢？因为
NCx
值在
Cut off
值计算中是相当举足轻重的
（详
后）。

（
2
）阴性对照（品）分为两类

一是代表受检人血清中并不含有、 或方法学灵敏度未能检出的待检物的基准水平，并且是结果
判断值（
Cut off
） 计算式中决定
“
是
”
（阳性）、或
“
否
”
（阴性）的唯一可变值。阴性对照值高，
导致假阴性；反之，导致假阳性。如：
HBsAg、
HBeAg
、抗
—
HBc
等。

二是阴性对 照设置，
在方法学上要求加入指示性定量标准品，
如中和剂
HBeAg
，定量
HBcAg
等，
用以检测抗
—
HBe
、
抗
—
HBc
。或者，选取代表平均水平的正常人血清用作阴性对照，如检测抗
—
HBc IgM
。此类
Cut off
值计算时，多数均包括阴性和阳性对照值
2
个可变值。

3
．阳性对照
（品）：

（
1
）阳性对照（品）的 概念与要求：同阴性对照（品），只是采用
“
精选
”
的含有待检物质的人血清制备而成。所谓
“
精选
”
，就是把收集的阳性人血清经过数种试验进 行
“
筛试
”
、把含有
“
干扰
性物质
”的血清剔除、不用，以避免出现
“
假阳性
”
干扰试验结果。

（
2
）阳性对照（品）设置，也可区分为两种类型与用途：

一是阳 性对照主要用于评价该项试验结果是否有效和试验结果的稳定性与可比性。而所设的阳
性对照的测量值不 列入
Cut off
值计算、但是不可不做。如
HBsAg
、抗
—< br>HBs
、
HBeAg
等。

二是阳性对照的设置，不仅用于评 价试验结果是否有效和试验结果的稳定性与可比性，而且计
入
Cut off
的计算。此时的
Cut off
值的含义是代表该标志物在健康（正常）人群中 正常值范围
的上限。待检样本检测值超过该上限（
Cut off
）时表示有诊断意义 。例如抗
—
HBe
、抗
—
HBc
、
抗
—< br>HBc IgM
等。

三．阴性与阳性对照平均值计算与判断

1
．阴性对照平均值
NCx
有效性计算判断举例
：

（
1
）第一类
NCx
计算与评价：以
HBsAg
为例

Ⅰ
.
设置
3
孔的
NCx
计算 ：
NCx=
（
0.011+0.010+0.090
）
/3=0.0 10
Ⅱ
.
任一个
NC
值应
≤0.100
至≥
－
0.010
；

Ⅲ
.
各
NC< br>值也应介于
≥0.5×NCx
至
≤1.5×NCx
之间。此时各孔的< br>NC
值均处于
NCx±
0.006
范围
内，其中遇有一孔NC
值偏离该范围时，则弃去该
NC
值，再计算
NCx
。如有< br>2
孔
NC
值超出
该范围时，本次试验（无效）应予复试。

Ⅳ
.
不同厂牌对
NCx
的具体要求略有不同，
但总的原则 几为一致，
如
<
法
>
巴斯德
HBsAg EIA Kit
。

（
2
）第二类
NCx
计算与评价：可包 括抗
—
HBc
、抗
—
HBe
。以抗
—
HB c
、抗
—
HBe
为例：

Ⅰ
.
取
3
孔阴性对照
A
值的平均值：

抗
—
HBc
NCx=
（
1.027+0.989+1.278
）
/3=1.065
抗
—
HBe
NCx=
（
1.169+1.088+0. 993
）
/3=1.083
；

请各位注意：
这
2
个
NCx
是不是很接近
1.00
呀？也就是说，
十分接近< br>C.O.I.
（
C.O./S
，
或
C.O./A
）< br>=1.00
！这不是一种偶然，而是国际试剂（如雅培）的
“
质量
”< br>标志。如果偏大，例如
1.50
以上，
或者偏小，
0.50
以 下，待检样本中会导致出现什么现象呢？请读者自己思考吧。

Ⅱ
.
各孔< br>NC
值均应＜
2.000
，并处于
≥0.5×NCx
至
≤1.5×NCx
之间。若其中
1
孔
NC
值偏离该范
围时 ，弃去，再计算
2
孔的
NC
值的
NCx
。如有
2< br>孔
NC
值偏离该范围时，应重新试验。

2
．阳性对照平均值
PCx
有效性计算与评价


也分为两类
：

（
1
）第一类

PCx
计算与评价：以
HBsAg
为例

Ⅰ
.
第一类
PCx
的计算不列入
Cut off
计算，
可取（设）
2
—
3
孔阳性对照的平均值
PCx
（
A bbott
）
：

PCx=
（
1.024+1.030）
/2=1.027
。注意：本例雅培试剂
HBsAg
的
Cut off
值
=NCx+0.05=0.06
，
PCx
的
S/ C.O.=1.027/0.06=17.12
。如果
S/C.O.
超过
20 .00
以上，提示
HBsAg
阳性对照含量太高！


Ⅱ
.
参照方法学的要求，也可规定
PCx
应
≥1.000
（指
A
值），而且各孔
PC
值要求
≥0.5×PCx
至
≤1.5×PCx

Ⅲ
. PC
的设置及
PCx
的计算，
主要用于评价本次试验结果是否有效和各批
/
次试验结果的稳定性< br>和可比性，
并不参与
Cut off
值的计算。
同一个批号试剂及其阳性对照品在规定保存条件和有效

2