HBcAgDNA疫苗诱导小鼠(H2b)特异性细胞和体液免疫应答.

2021年1月25日发(作者：郝致华)





HBcAg
DNA
疫苗诱导小鼠
(H2b)
特异
性

细胞和体液免疫应答













摘要

目的

观察
HBcAg DNA
疫苗
(pJW4303/H Bc)
免疫
C57BL/6
小鼠
(H-2
b
)
的特 异性细胞和体液免疫应答。方法

基因枪和肌肉注射两种方法接种
51
DNA
疫苗；
ELISA
法检测小鼠血清抗
-HBc(IgG)
及
IgG
亚类
(IgG1,IgG2a)
；
铬
释放法检测小鼠脾细胞< br>HBcAg
特异性
CTL
活性。结果

该
DNA疫苗体外可表达
HBcAg
；小鼠经基因枪或肌肉注射接种该疫苗后血清抗
-HB c
滴度分别达
1
∶328
050
和
1∶109 350； 肌肉注射组抗
-HBc
亚类以
IgG2a
为主；两种方法接种小鼠
b
的特异性
CTL
杀伤率分别达
53.1%
和
52.8%。结论

HBcAg DNA
疫苗在
H-2
小鼠
实验中 表现出良好的细胞免疫和体液免疫原性。



关键词

肝炎核心抗原，乙型


DNA
疫苗


小鼠

Specific cellular and humoral immune responses in H-2
mice
induced by DNA immunization of HBV core gene


HUANG Zuhu,LU Shan, LIU Ning,et al.
The First Affiliated Hospital
of Nanjing Medical University,Nanjing 210029



Abstract

Objective
To observe the specific cellular and humoral
immune responses in H-2
b
mice after DNA immunization of HBV core
s
The DNA vaccine(pJW4303/HBc) was constructed by
inserting HBV core gene fragment into the reading frame of plasmid
immunization was performed by gene gun and intramuscular
injection in this -HBc(IgG)and its
subtypes(IgG1,IgG2a)in mice sera were detected by
specific cytotoxic T lymphocyte (CTL) activity was measured by
51

Chromium release s
The expression of HBcAg was
demonstrated by ELISA and Western-blot in 293T cells transfected with
pJW4303/ end-point titers of serum anti-HBc in immunized mice
were 1∶328 050 (gene gun method) and 1∶109 350 (intramuscular
method).In both groups of gene gun and intramuscular
immunization,IgG2a level was sightly higher than that of
specific CTL activities were 53.1% in gene gun group and 52.85%in
intramuscular sionThe results showed that the DNA vaccine
of pJW4303/HBc had strong antigenecity in both cellular and humoral
b
immunity.


Key words

Hepatitis B core antigen

DNA vaccine

Mice


DNA
疫苗
(
基因疫苗
)
是近几年免疫学和分子生物学研究的新兴领域，被称
之为疫苗的“第三次革命”。< br>DNA
疫苗的显著特点之一是目的基因进入机体后
的表达产物系内源性抗原，主要通过< br>MHC-
Ⅰ类途径激发机体的免疫应答，其中
特异性
CTL
应答尤为突 出
［
1
］
。大量资料表明，慢性乙型肝炎患者和乙型肝炎病
毒
(HBV)
慢性携带者体内针对
HBV
的特异性
CTL
应答明显低 下，纠正这种
CTL
低
反应状态，对于机体有效地清除
HBV
至关重 要
［
2
］
。鉴于
HBV
核心区基因产物
HBcAg
是机体
CTL
的主要靶抗原，我们构建了
HBcAg DNA
疫苗， 并观察了该
DNA
疫苗经基因枪和肌肉注射法接种后
H-2
b
小鼠的 特异性细胞和体液免疫应答。

材料与方法



一、
HBcAg DNA
疫苗的构建



将经过
5′端修饰的
HBV
核心区基因片段
［
3
］
(购自中国预防医学科学院病毒
研究所
)
插入质粒
pUC18(Prome ga)
的
PstI
和
BamH1
酶切位点，克隆成功后，再
将该重组质粒中含
HBV
核心区基因片段的
Hind III
和
Ba mH1
酶切片段定向克隆
进质粒
pJW4303(
系真核表达质粒，含
CMV
即刻早期启动子，由美国马萨诸塞大
学医学中心
HL Robinson
教授惠赠
)
的相应克隆位点。该重组质粒即为
HBcAg
DNA
疫苗，命名为
pJW4303/HBc
。



二、
pJW4303/HBc
体外表达产物的鉴定



分别取纯化的
pJW4303/HBc
和
pJW4303(
无目的基因的对照质粒
)
约
20
μ
g
，
用磷酸钙 法转染
293T
细胞
(
一种用于瞬间转染的人胚肾细胞系
)
，
72
小时后收
集并裂解细胞，低温下离心取上清。该细胞裂解产物经间接
E LISA
法检出
HBcAg,
经
Western-blot
证实在< br>21Kd
处有一清晰蛋白质条带，与
HBcAg
分子量
相符；对照质粒 的转染细胞裂解产物未检出
HBcAg
。



三、
pJW4303/HBc
和
pJW4303
的大量制备



采用
QIAGEN Plasmid Purification(Giga)Kit(GIAGEN Inc.,Germany)
。
每
2000mlHB101
转化株菌液可获高纯度质粒约
10mg
。



四、小鼠来源、分组及血清标本采集



6
～
8
周龄雌性
C57BL/6(H2
b
)
小鼠 由美国马萨诸塞大学医学中心动物实验中
心提供。共设
4
组，每组
5
只小鼠，耳洞法编号。组别为
pJW4303/HBc
基因枪
组、
pJW43 03
基因枪组、
pJW4303/HBc
肌内注射组及
pJW4303
肌内注射组。采用
毛细吸管眼静脉采血法采集小鼠血清，
-
70°C
冻存。



五、免疫方法及免疫程序



(
一
)
基因枪法

基因枪为
Agrecetus Inc.(U.S.A)
产品，系高压氦气驱动
类型。按
2
μ
m质粒
DNA∶1mg
金颗粒
(1
μ
g,BIORAD)
的比例分别制备含
pJW4303
和
pJW4303/HBc
的基因枪专用细 管状子弹。每粒子弹含质粒
DNA 1
μ
g
。每只小
鼠每次在腹部皮 肤
6
处不同部位接受注射，基因枪所用压力为
400psi
，接种剂
量为
6
μ
g
质粒
DNA/
次小鼠。根据文献报道，未设单纯 金颗粒对照组
［
4
］
。



(
二
)
肌内注射法

取相应质粒
DNA 100< br>μ
g
，以无菌生理盐水稀释至
100
μ
l
。每只小鼠 每次在其两后肢四头肌处各注射
50
μ
l
，故接种剂量为
100μ
g/
次小鼠。



(
三
)
免疫程序

为
0
周、第
4
和第
8
周。每次免疫时接种方法及剂量相
同。每次免疫前及第
10< br>周时采集小鼠血清。



六、抗
HBcIgG
及
IgG
亚类检测



(
一
)
抗
-HBc-IgG
检测
< br>以重组
HBcAg(
南京军区医学研究所张林元研究员
惠赠
)0.1< br>μ
g/100
μ
l
孔包被
96
孔
ELISA
板
(Corning)
。待测小鼠血清作系列
3
倍稀释(1∶50， 1∶150，1∶450……1∶885735
0)
。以生物素化羊抗鼠
IgG
和亲
和素偶联
HRP(Vector Laboratory Inc.)
检测小鼠 血清中抗
HBc
终点滴度。抗
HBc
高滴度血清采用
CORZYME
试剂盒
(Abbott)
作抗
HBc
定量测定，并转换成
P EI(Paul Ehrlich Institute)
单位。



(
二
)
抗
HBcIgG
亚类检测

以小 鼠
IgG1
，
IgG2a
标准品、
HRP
标记的羊抗
鼠
IgG1
或
IgG2a(Southern Biotechnology As sociates,Inc.)
为主要试剂，分
别检测单个小鼠血清中抗
HBcIgG 1
和
IgG2a
水平，根据
A(450nm)
值计算
IgG 2a/IgG1
比值。



七、特异性
CTL
功能测定



pJW4303 /HBc
或
pJW4303
末次免疫
4
周
(
即第< br>12
周
)
时，在麻醉状态、无菌
条件下取小鼠脾脏，制备单个细胞悬液 ，分别用或不用
H-2
b
小鼠限制性
HBcAg
特异性
CT L
表位多肽
［
5
］
(
序列为
MGLKFRQL，终浓度为
10
μ
g/ml)
作体外刺激，
37°C
培 养
6
天。继以
EL4
细胞为靶细胞
(
用或不用上述多肽进行 过夜孵育
)
作
51
Cr
释放试验
(4
小时孵育法< br>)
，测定
HBcAg
特异性
CTL
杀伤活性，效应细胞：靶< br>细胞范围为
12∶1～0.5∶1。



特异性
C TL
杀伤率
(%)=
［
(
实验孔
Cr
释放值
-
自然
Cr
释放值
)/(
最大
Cr
释
放 值
-
自然
Cr
释放值
)
］×100。

结果



一、各组小鼠血清抗
HBc
终点滴度



见表< br>1
。接种
pJW4303/HBc
后小鼠产生了较高滴度的抗
HBc< br>。基因枪组的终
点滴度
3
倍于肌内注射组。经定量检测，终点滴度达
1 ∶109 350
及以上的血清
标本中，抗
HBc
含量均大于
900 PEI
单位。
pJW4303
接种后小鼠仅有低滴度非特
异性抗体反应(≤1 ∶450)。



二、单个小鼠血清抗
HBc
终点滴度的比较



见
1
。基因枪组各小鼠血清抗
HBc
的滴度

表
1
各组小组血清抗
HBc
的终点滴度

采

样

时

间

0
周
4
周

8
周

10
周

50
150
450
50
150
150
450
450
组


别

pJW4303
基因枪组

pJW4303
肌内注射组

pJW4303/HBc
基因枪组

50
4050
109350
328050
pJW4303/HBc
肌内注射组

50
4050
36450
109350