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HPV病毒的常用通用引物检测

作者:陕西保健网
来源:http://www.xapfxb.com/yuer
更新日期:2021-01-24 11:55

子宫卵巢保养-

2021年1月24日发(作者:聂远)
HPV
病毒的常用通用引物检测


摘要

研究表 明,
HPV
病毒感染与人体多种肿瘤的发生相关。对感染个体
的病毒检测具有重要的疾 病诊断、
治疗、
预防意义。
但目前缺乏可以兼顾敏感性、
特异性、
操 作简单,
可以大规模推广使用的可靠检测方法。
对待测样本进行
PCR
检测仍 是目前实验室最多采用的检测方法。
PCR
具有高敏感、易操作的优点,
但其反应的灵 活性和极高的敏感性,
也带来了假阳性和假阴性的问题。
针对
HPV
病毒L1
序列保守区域设计的通用引物检测,最常被应用于大样本检测。通用引
物可以在一次< br>PCR
反应中同时检测多种型别的
HPV
病毒感染,
与序列特异
PCR
检测相比,
可以大大减少检测的工作量。
但其缺点在于,
通用引物仅 与某个或少

HPV
型序列匹配,而对于多数型别
HPV
,引物结合 区都存在或多或少的碱基
错配。这使得通用引物对不同型别的
HPV
扩增效率不同。因 此,使用通用引物
检测
HPV
感染时,
对于某些与引物匹配较差的
H PV
型别,
其感染情况往往可能
被低估。目前常用的通用引物根据设计原则不同分为三 类:
1
)单一引物如:
GP5+/6+

2
)简并引物如:

MY09/11

3
)混合引物如:
SPF1/2
。个型通用引物
都有其各自的优缺点,
需要根据特定试验的目的、
条件选用合适的通 用引物进行
检测。

【关键词】


HPV
病毒;通用引物;单一引物;简并引物;混合引物


HPV
病毒是一种亲上皮细胞的双链
DNA
病毒,其基因组长约
7900bp
。目
前约共发现约
200
多型
HPV
病毒。该病毒主要感染皮肤和 粘膜的上皮细胞,造
成上皮增生甚至恶性转化
[1] [2] [3]
。人们已经在生 殖道检测到超过
40
型的
HPV

其中许多与宫颈内皮增生及宫颈癌 密切相关,如:
16

18

31

33

35
等,这
部分
HPV
病毒被称为高危型
[4][5]< br>。而
HPV6

11
等型别主要存在于良性病变中,
[6][ 7]
多造成生殖道疣等疾病,被称为低危型

但人为区分的高危型和低危型并不
[8]
是绝对的,因为在一些癌变中确实也存在所谓的低危型
HPV



多数
HPV
病毒对人体的感染都是一过性的,病毒很快会被人体 免疫系统清
除。但少数情况下,病毒整合入宿主基因组
DNA
,转变为持续感染
。这种感
染方式被认为与感染部位的恶性病变相关
检测到
HPV
病毒的存在
[11] [12]
[10]
[9]

接近
100
%的宫颈癌样本中都可以

据估计,
每年约
290,000
人死于宫 颈癌。
同时每
[13]
年有
490,000
例新发宫颈癌病例
。因此,对
HPV
病毒有效的检测方法,将具
有重要的临床和社会意义。目前,HPV
病毒尚不能人工体外培养,而
HPV
的血
清学检测技术也不成熟。 因此,对
HPV
感染的检测方法仍然局限于使用分子生
物学的方法在待测样本中直接检 测,如:原位杂交、液相杂交(杂交捕获技术)

[14] [15] [16] [17] [18]
。但是这些方法不但操作复杂,而且敏感性有限。
HPV
病毒
PCR
检测虽然具备操作简单、高敏感性的优点,但污染严重、容易产生假阳
性,
因此无法推广到临床应用。
目前尚缺乏一种能克服上述所有缺点,
同时保持
各自优点的 成熟检测方式。

对于具有严格的污染控制,同时需要高敏感、大样本的检测
HPV< br>病毒的实
验室,使用
PCR
检测仍是首选方案。但是鉴于
HPV
存在如此多的类型,对每一
型都使用其特异引物进行
PCR
检测将是十分巨大量的工 作。
同时,
序列特异
PCR
只能扩增序列已知的
HPV
。对 于未知
HPV
型或存在变异的
HPV
则不能有效扩
增检测。因此,人 们选取
HPV
基因组序列中较为保守的
L1

E1
基因区域 设计
通用引物,
以实现在单一
PCR
反应中同时检测多种型别
HPV
的目的
[19] [20] [21]

本文对目前常用的
HPV< br>通用引物进行了综述,在各自引物的序列分析基础上,
对其优缺点进行了阐述。

一、
HPV
病毒的
PCR
通用引物检测

通常,通 用引物的设计遵循三条原则:
1
)上下有引物均为惟一序列,通用
引物只与某一型或少 数几型
HPV
扩增序列完全匹配。
在多数
HPV
型的引物结合
区域,
通用引物均存在或多或少的碱基错配。
使用该种类型的通用引物,
应当使用较低的煺火温度,以保证引物可以与存在碱基错配的
HPV
型结合。这种通用
引 物的代表为
GP5+/6+
[22]
[23]

2
)通用 引物由一系列简并引物混合而成,这些
引物的某些特定位点随机出现两到三种不同的碱基,
通过 这种方法来弥补不同型

HPV
在这些位点的序列差异。简并引物的代表为
M Y09/11
[24]

3
)通用引物
的上下游均由一系列不同的引 物混合构成,这些引物充分考虑了各型
HPV
在特
定位点的序列差异,在混合引物中, 尽量存在与各型
HPV
均达到碱基完全配对
的引物。对于某些多数
HPV都在此处存在较大的序列差异的位点,这种通用引
物在此位点引入肌苷来替代常规的碱基。
这一位点的肌苷虽然不能与模板序列形
成共价配对,但也不致形成空泡。这种通用引物与各型
H PV
碱基配对都较好,
因此可以采用较严格的
PCR
条件。其检测效率和敏感 性也较高。代表引物为
SPF1/2
[25]


各种类型的通用引 物都存在其各自的优缺点,
本文将分别代表性的介绍这三
种通用引物。

1< br>.
GP5/6

GP11/12

GP5+/6+
通 用引物


1

GP5/6

GP11/12引物序列及其与
9

HPV
病毒的匹配情况









小点表示各型
H PV
序列与引物序列相同,各型
HPV
序列与引物序列的差异用相应碱基字
母 标出


GP5/6

GP11/12
通用引物由
Peter J. F. Snijders
等于
1990
年发表,其目的
是开发一种可以方便、敏感的
HPV
广谱检测方法
[26]
。这两对通用引物都扩增
HPV L1
基因的一段保守序列。其中,
GP5/6
针对感染生殖道的
HPV< br>类型如:
HPV6b

16

18

33< br>型,
GP11/12
针对感染皮肤的
HPV
类型如:
1a
5

8
型等。
与以往的序列特异引物相比,
GP5/ 6

GP11/12
通用引物在大规模检测
HPV

毒时具 有较显著的优势。它实现了高通量检测,只需通过一次
PCR
反应,就可
以扩增样本中 的多种不同类型
HPV
病毒。
虽然该引物只与少数几型
HPV
病毒序
列完全匹配,多数型别的
HPV
病毒在引物结合区都存在碱基错配,但作者的研
究证实,当错配在三个以下时,并不会显著影响
PCR
的扩增效率。不可否认,
使用 该通用引物扩增
HPV
病毒序列存在许多局限性。首先,由于错配序列的存
在,引物与 模板的结合势必受到影响,这将大大降低
PCR
扩增的效率。因此,
使用这两对通用引 物进行
PCR
扩增时,
常常需要使用与平常不同的
PCR
反应条件。作者推荐了
40
度的退火温度及
3.5

10 mM
Mg
离子浓度。在这种情况
下,尤其是扩增模板的拷贝数较低时,
PC R
扩增产物往往会产生许多非特异条
带,影响研究人员对结果的判断。对于包含较多非特异条带 的
PCR
产物分析,
作者推荐使用
south
blot
杂 交的方式进行。其次,在作者发表这两对引物时,仅

9
种类型的
HPV病毒序列得到测定,
现在已知的多数
HPV
病毒类型的序列仍
然处于未知 状态。因此,作者设计
GP5/6

GP11/12
时可用的
HPV
病毒序列信
息是有限的,不可避免存在较大的改进空间。

虽然具有局限性,
但这两对通用引物尤其是
GP5/6
及其衍生物仍然是十分成
功的,因为它较 早的实现了高通量
HPV
病毒检测
[27]



2

GP5+/6+
引物序列及其与
23

HPV
病毒的匹配情况









小点表示各型
HPV
序列与引物序列相同,各型
HPV
序 列与引物序列的差异用相应碱基字
母标出

对通用引物
GP5/6
的 序列分析,发现
HPV
病毒序列的引物结合区域向
3′

延伸仍然存 在数个碱基的保守序列。据此,
Ana-Maria de Roda Husman
等通过对
GP5/6
通用引物的改进发展了新的通用引物,
称为
GP5+/6+
[28]

由于引物结合区
域配对碱基序列比
GP5/6
多,GP5+/6+
具有相对较高的特异度和敏感度。
在对
22
例克隆的HPV
病毒序列扩增实验中,
GP5+/6+
的敏感度比
GP5/6
10

100
倍。
并且在对
PCR
产物的电 泳分析发现,
GP5+/6+
产物的特异度好,
杂带少。
GP5+/6+通用引物的检测敏感性仍然与引物结合区域的碱基匹配程度相关。当
GP5+/6+
引物与 模板匹配较好时,可以检测到飞克(
femtogram
)水平的病毒序列,而当
其中 一个引物或引物对与模板存在
4
个或更多碱基错配时,只可以检测到皮克

p icogram
)水平。


GP5
引物向
3′
端 延伸三个碱基,

TAC

CAC
两种选择
(如图
2
所示)

研究发现,当选择
CAC
序列时,引物内部容易形成六个 碱基的互补结构,这样
的结构会促使引物二聚体的形成,反而使检测敏感性下降。选择
TAC< br>序列则不
会出现此情况。与此相同,
GP6
引物向
3′
端延申 有两种选择(
5'TACTC
3'

5'TATTC 3'

,根据同样原因而选择了
5' TACTC 3'
序列。虽然
GP 6+
引物的
3′

仍然存在
3
个碱基的保守序列,
但研究者并没有继续向外延伸,
因为那样将会使
两条引物的
Tm
值相差过大。 并且,引物过长,必然需要提高
PCR
反应的煺火
温度,这也不利于与引物存在较多剪 辑错配的
HPV
型的检测。虽然比起
GP5/6
来说,
GP5+/6 +
引物在多数

HPV
型中都引入了一个或更多的碱基错配,但是这
对引物总体上提高了引物与模板的结合能力,使用这对引物进行
PCR
反应可以
获得更 好的特异性和敏感性。

研究人员对
GP
引物的改进,并没有局限在序列的优化方面。
Mark F Evans
等发展了递减
PCR

Touchdown PCR

的方法来获得更敏感及更特异的
PCR


[29]
。递减
PCR
通过在
PCR
的前几个循环使用严紧的退火条件提高特异性。
循环设在比估算的
Tm
高大 约
5

的退火温度下开始,然后每个循环降低
1


2

,直到退火温度低于
Tm
5

。因此,在反应的前 几个循环,特异性最高的目
的片段会被优先扩增,
这些产物在随后的循环中继续扩增占据优势。
这样就允许
后续循环中使用较低的煺火温度而不至于影响反应的特异性。

递 减
PCR
可以很好的扩增模板很少的样本以及与通用引物序列结合区域存
在较多错配的
HPV
类型。
在作者发表的论文中,使用
Touchdown PCR
检测宫颈
癌样本比经典的
GP5+/6+
PCR
条件发现了 更高的阳性率和更多的感染型别。另
外,经典的
GP5+/6+
PCR
条件 检测
26
例乳腺癌样本的阳性率为
19
%,而使用
Touchdow n PCR
检测的阳性率为
58
%。

通过对宫颈脱落细胞样本检测研究表明,使用
GP5+/6+
进行
PCR< br>后,产物
凝胶电泳分析时的敏感性比
GP5/6
提高
11
%。 如果使用混合探针对
PCR
产物进
行杂交分析,敏感性提高
4
%。但 是,在
GP5+/6+
阳性而
GP5/6
阴性的样本中,
不包括六种 在宫颈中常见的
HPV
类型。
这是因为这些
HPV
型的引物区序列本 生
就与引物匹配性很好,引物的修改没有显著的增加其扩增效率。
GP5+/6+
虽然 具
有较高的扩增效率,
也仍然存在一些缺陷,
如对
HPV52
一种常 见的宫颈高危
HPV
扩增效率不高
[30]
。但作为一种成功的通用引物,< br>GP5+/6+
对于大规模人群筛查,
[31]
及多种类型
HPV感染,
HPV
多重感染样本的检测具有意义



3< br>:
GP5+/6+
的普通
PCR
条件和
Touchdown PCR
反应条件比较













2

MY09/1 1/HMB01

PGMY09/11
通用引物


4
MY09/11/HMB01
引物序列及其与
18

HPV< br>病毒的匹配情况










小点表示各型
HPV
序列与引物序列相同,各型
HPV
序列与引物序列的差异用相应碱基字
母标出

简并碱基表示如下:
M


A


C, W

A

T, Y

C


T, R


A


G

MY 09/MY11

Manos
等于
1990
年最早发表
[2 4]
。当时,仅有
HPV6

11

16

18

33
五种病毒序列被研究人员完全掌握。
所以基于这五种
H PV
病毒序列,
人们选择了
L1
基因的一段保守序列设计通用引物,并希望该 引物可以通过一次
PCR
过程同时扩增出这五型
HPV
病毒。为了推广应用该 引物,研究人员假定其
他序列没有完全知道的
HPV
病毒基因序列在这一段也是保守的 ,同样适用于该
引物扩增。事实上,
MY09/MY11
引物只与
HPV6< br>型的引物结合区域序列完全匹


其它几型都存在在一些碱基位点的序列差异。
为了使引物能够更好的与存在
序列差异的结合区煺火,该引物的设计者采用了简并碱基的方式。 因此,
MY09/MY11
是由
24
条序列存在差异的不同引物混合而成的。 事实证明,
MY09/MY11
是十分成功的通用引物
[32] [33]

它可以有效扩增超过
30
型的生殖道
HPV
病毒。
MY09 /MY11
扩增约
450bp
长的片段,
可以为研究人员提供较多的病
毒序列信息
[34]
[35] [36]



但是作为 简并引物,
MY09/MY11
的缺点也很明显的。
简并引物的合成需要
在引 物序列的特定位点随机插入两到三种不同的碱基,这一过程是不可控制的,
导致人们无法保证在混合引物 中每一种特定的引物序列都能够以相同的几率出
现。
因此,不同批次合成的
MY09/ MY11
实际存在差异,而这种差异往往导致不
同批次合成的引物对相同样本中病毒的扩增也会 出现效率不同的问题。
这种缺点
对于需要扩增条件稳定、
试验结果均一、
的大 样本病毒感染率检测是十分不利的。



5

PGMY09/11
引物组成









PGMY09

I

PGMY09

P
5′
端删除两个碱基,避免引物出现内部发卡结构,影响
PCR
扩增。

HMB01
设计针对
HPV51
型,此型病毒为高危型,并且
PG MY
引物不能有效扩增。


P.
E.
GRA
VITT
等针对
MY09/11
的缺点进行了改进,于
2000
年发 表了
PGMY09/11
通用引物
[37]

PGMY
通用 引物的引物结合区域与
MY09/11
相同。
但该引物不使用简并引物,而使用了与< br>SPF1/2
相似的混合引物。
研究人员通过
序列分析,将已知的
HP V
病毒序列根据
MY09/11
引物结合区域相似性分组,再
根据每组的序列 匹配性,设计了由
5
条序列组成的
PGMY11
,及由
13
条序列组
成的
PGMY09

PGMY09/11
避免了使用简并引 物,混合引物中每条引物都是单
独合成并以相同的比例掺入到混合引物池中。
PGMY09/1 1
通用引物保证了每条
引物都能以固定比例存在,从而确保了不同批次合成引物的均一性。
在一项研究中,
科研人员使用
MY09/11

PGMY09 /11
分别检测了
262
例宫
颈脱落细胞样本。
[38]
结 果发现,
PGMY09/11
的阳性样本比
MY09/11

20< br>例

62.8%

55.1%


同时,< br>PGMY09/11
的多重感染检测率也比
MY09/11


40.0%


33.8%


HPV 26, 35, 42, 45, 52, 54, 55, 59, 66, 73,

MM7
型使 用
PGMY09/11

检测率比
MY09/11

25%
。所以,
PGMY09/11
引物提供了一种比
MY09/11
更< br>加敏感、特异的检测方法
3

SPF1/2
通用引物


6

SPF1/2
引物及探针组成

[39] [40] [41] [42]











i
代表次黄嘌呤核苷(
inosine



7< br>:
SPF1/2
引物结合区域
38

HPV
病毒的碱 基位点差异













HPV16
型为代表,
小点表示各型HPV
序列与其序列相同,
各型
HPV
序列与
HPV16
型序列的差异用相应碱基字母标出


由于现存的通用引敏感性较低、包括的
HPV
类型局限等问题,
Bernhard
Kleter
等于
1 998
年发表了
SPF1/2
通用引物
[25]

希望开发 一种敏感性高、
检测类

子宫卵巢保养-


子宫卵巢保养-


子宫卵巢保养-


子宫卵巢保养-


子宫卵巢保养-


子宫卵巢保养-


子宫卵巢保养-


子宫卵巢保养-



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