病毒分子生物学鉴定常用技术

2021年1月24日发(作者：严宏谟)
实验二十三


病毒核酸检测常用技术

（
Techniques of Detecting Nucleic Acid of Viruses in
Common Use
）


近年来随着 分子生物学的发展，
基因检测技术在微生物学实验室诊断中也取得了长足的
进展。
由于 部分病原微生物的基因组已成功地被克隆并进行了核苷酸序列测定，
因此根据病
原微生物
的
基因特点，
应用分子生物学技术检测样品中有无相应病原微生物的核酸，
从而可
以特异、
灵敏地
判定
标本中
是否含有
相应的病原微生 物。
在微生物学的研究及感染性疾病的
诊断中
，
最常使用的微生物核酸检测技 术有
PCR
、
RT-PCR
、核酸杂交等技术，现对病毒核
酸（DNA
、
RNA
）的分离、
PCR
、
RT-PCR、核酸杂交等技术的基本原理、操作
方法
、应用
及影响因素等进行概述。



实验
1 PCR
检测传染性喉气管炎病毒核酸


【目的要求】


通过本实验使学生初步了解和熟悉病毒核酸（< br>DNA
）的分离与
PCR
技术的基本原理、
操作
方法
、影响因素和应用。

【基本原理】

鸡传染性喉气管炎
(Infectious laryngotracheitis, ILT )
是由疱疹病毒科
、
α
-
疱疹病毒亚科的喉
气管炎病毒(Infectious laryngotracheitis Virus, ILTV)

引起的一种急性上呼吸道传染病
,
常表现
呼吸困难、产蛋鸡产蛋下降和死亡
,
是危害养鸡业发展的重要疫病之 一。但在临诊上极易与
其
它
一些呼吸道疾病相混淆
,
如禽流感、新城疫、传染性支气管炎、支原体感染等。常规检
测
IL TV
的方法有病原分离鉴定和血清学试验
,
这些方法虽经典
，
但费时且敏感性差
,
不能
检测亚临床感染
,
而传染性喉气管炎潜伏感染
是疾病的一种重 要表现形式
。
聚合酶链式反应
（
Polymerase Chain Rea ction
，
PCR
）是目前比较快速、敏感、特异的检测手段，已被广泛应
用在病毒核酸检测方面。
本实验以
PCR
方法检测鸡传染性喉气管炎病毒核酸为例，< br>对
PCR
方
法进行介绍。

PCR
是体外酶促合成特 异
DNA
片段的一种方法，典型的
PCR
由（
1
）高温变性 模板；
（
2
）引物与模板退火；
（
3
）引物沿模板延伸三步 反应组成一个循环，通过多次循环反应，
使目的
DNA
得以迅速扩增。其主要步骤是： 将待扩增的模板
DNA
置高温下（通常为
93
～
94
℃）< br>使其变性解成单链；
人工合成的两个寡核苷酸引物在其合适的复性温度下分别与目的
基因 两侧的两条单链互补结合，
两个引物在模板上结合的位置决定了扩增片段的长短；
耐热
的
DNA
聚合酶（
Taq
酶）在
72
℃将单核苷酸从引物的
3
’端开始掺入，以目的基因为模板
从
5
’→
3
’ 方向延伸，合成
DNA
的新互补链。如此反复进行，每一次循环所产生的
DNA
均能成为下一次循环的模板，每一次循环都使两条人工合成的引物间的
DNA
特异区拷贝数< br>扩增一倍，
PCR
产物得以
2
n
的批数形式迅速扩增，
经过
25
～
30
个循环后，
理论上可使基因
扩增
10
9
倍以上，实际上一般可达
10
6
～
10
7< br>倍（图
23-1
）
。


图
23-1

PCR
基本原理示意图



本实验是将被检样品中
ILTV
颗粒经裂解、变性后，分离
ILTV
—
DNA
。选择鸡传染性喉
气管炎病毒的
TK
基因保守序列设计引 物，由于引物与鸡传染性喉气管炎病毒的
TK
基因存
在着特异的互补性，当加入
DNA
聚合酶后，就会在引物的引导下合成该段基因，
该
基因片
段通过人工
扩增后，经含溴乙锭
的
琼脂糖
凝胶
电泳，
在
紫外灯下可显示橙红色
ILTV
—
DNA
条带，根据片段大小来
判 定
标本中鸡传染性喉气管炎病毒的存在。

【器材准备】

1
．
病毒裂解液：
醋酸钠
1.7g
，
EDTA
钠盐
4.65g
，
20mg
/
ml
蛋白酶
K 2.5ml
，
100g
/
L SDS
10ml
，
DEPC
三重蒸馏水加至
50ml
。

2
.
3mol/L
醋酸钠缓冲液
(pH 5.2)
，酚
/
氯仿
/
异戊醇混合液
(25
：
24
：
1)
，
无水乙醇及
70
％
乙醇。





3
.
2.5mmol dNTPs
：含dA
TP
、
dCTP
、
dGTP
、
dTTP< br>各
2.5mM
。








4
.
10
×
PCR Buffer
，

Taq DNA
聚合酶。

5
.
DNA
分子量标准。

6
.
上样缓冲 液：
2.5g/L
溴酚蓝、
400g/L
蔗糖水溶液。
10mg/m l
溴乙锭
(EB)(
具致癌性，
操作时应戴手套
)
，琼脂糖 。





7
.
50×
TAE
缓冲液：
242g
Tris
，
57.1mL
冰乙酸，
100mL
0.5mol/L
EDTA
（
pH8.0
）加三
蒸水定容 到
1000mL
。使用液为
1×
。





8
.
ILTV
北京
E2
株、
ILTV-DNA
可疑组织样品、
ILTV- DNA
阴性组织样品等。

9
.
引物序列
:
参考 已发表的
ILTV
的
TK
基因序列
,
设计并合成了一对引物
,
其序列如下：
引
物
P1
：
5
’
-TTCGAGAACGATGACTCCG-3
’
；
引物
P2
：< br>5
’
-ATAGTCA
TCTGAACTTCCGC-3
’
。

10
.
仪器：台式高速离心机、
PCR
扩增仪、电泳仪、 水平式电泳槽、紫外透射反射分析
仪、微量加样器、
Eppendorf

管与吸头等。

【实验步骤】

1
.
病毒核酸的分离

（
1
）取
ILTV-DNA
可疑组织样品上清液
200μ
L
、病毒裂解液
20
μ
L
于
Eppendo rf
管中，
60
℃水浴
1h
，同时设
ILTV
北京
E2
株、
ILTV-DNA
阴性组织样品对照。

（2
）加酚
/
氯仿
/
异戊醇混合液
200
μL
，上下颠倒混匀，
14000rpm
离心
5min
，吸上清液
于另一新的
Eppendorf
管中。

（
3
）加
1/10
体积的
3
mol/L
醋酸钠缓冲液
(pH
5.2)
及
2
倍体积的无水乙醇，
-20
℃过夜。

14000rpm
离心
15min
，弃上清液。





（
4
）加
70
％乙醇至
E ppendorf
管
2/3
处，混匀，洗涤沉淀。
14000rpm
离心
15min
，弃上
清液，室温中使乙醇挥发。

2
.
加样及
PCR
扩增


（
1
）按以下次序将各成分加入
0.5ml
灭菌
Eppendorf
管中。


10
×
PCR buffer














5
μ
l

2.5mM dNTPs

















4
μ
l


引物
P1
（
25pmol/
μ
L
）







2
μ
l


引物
P2
（
25pmol/
μ
L
）







2
μ
l

Taq DNA
聚合酶（
5U/
μ
l
）










0.5
μ
l

模板液

（病毒核酸的分离液

）








1
μ
l

加
ddH
2
O
至















50
μ
l

（
2
）将上述混合液稍加离心，调整好反应程序，立即置
PCR
仪上，执 行扩增。一般在
94
℃预变性
3min
，进入循环扩增阶段：
94< br>℃

60s
→
58
℃

30s
→
72
℃

60s
，循环
30-3 5
次，最
后在
72
℃保温
7min
。

3
.
电泳检测

（
1
）
将倒胶槽两端用透 明胶带封闭并放置在水平的台面上，
放好梳板，
使梳板齿下沿距
倒胶槽板
1m m
。




（
2
）
配制合适浓 度的琼脂糖凝胶，
如配制
1.2
％的凝胶，
则称取琼脂糖
1.2g< br>于三角瓶中，
加入
100ml 1×
TAE
电泳缓冲液，
置微 波炉中加热煮沸后以蒸馏水补足体积至
100ml
，
迅速混
匀，待冷至
60
℃左右时，加入
100
μ
L 0.5mg/ml
的
E B
液，充分混匀。倒胶至倒胶槽内，使
厚度为
3
～
5mm
， 排除气泡后待胶完全凝固，撕去两端胶带。




（
3< br>）将倒胶槽置电泳槽中，加入
1×
TAE
电泳缓冲液使
其
没过 胶面
2
～
3mm
，轻轻拔出
梳板。




（
4
）加样：取
2
μ
L
上样缓冲液于< br>Parafilm
膜上，加入
PCR
产物
5
μ
L，混匀后，加入
点样孔中，不要溢出孔外。
同时设
DNA
分子量标准。< br>
（
5
）电泳：样品在负极端，接通电源，
5V/cm
恒压电 泳
30
～
60min
即可。

（
6
）检测 ：电泳结束，关闭电泳仪电源
，
取出倒胶槽，将电泳完毕的琼脂糖凝胶放在紫
外灯300nm
下观察，可见桔红色明亮带，根据电泳条带的位置判断结果。

4
.
结果判定

在阳性对照
孔
出现相应扩增带、阴 性对照
孔
无此扩增带时判定结果。

若样品扩增带与阳性对照扩增带
（约
265bp
）
处于同一位置，
则
判定为
ILTV- DNA
阳性，
否则判定为阴性。

【注意事项】

1
.
所有实验结果都有成功或失败，
实验的失败可能是应该出结果而没有出，
我们把它 称
作假阴性，不该出结果而出了结果我们把它称为假阳性。
PCR
实验中最常见的问题 就是假
阴性和假阳性问题。

（
1
）
假阴性：出现假阴性结果最常见的原因有
Taq DNA聚合酶活力不够，或活性受到抑
制；引物设计不合理；提取的模板质量或数量不过关以及
P CR
系统欠妥当；
循环次数不够。
为了防止假阴性的出现在选用
Taq DNA
聚合酶时，要注意用活力高、质量好的酶。同时在
提取
PCR
模板 时，
应特别注意防止污染抑制酶活性物质
（如酚、
氯仿）
的存在。
尽 管
Taq DNA
聚合酶对模板纯度要求不高，但也不允许有破坏性有机试剂的污染。保证引物 的
3
’
端与靶
基因的互补。
PCR
反应的各温度点的设置要 合理。


（
2
）假阳性：
PCR
反应的最大特点 是具有较大扩增能力与极高的灵敏性，但令人头痛的
问题是易污染，极其微量的污染即可造成假阳性的产 生，所以污染是
PCR
假阳性的主要根
源。污染的原因可能有：

①

样品间交叉污染。样品污染主要有收集样品的容器被污染，或样品放置时，由于密
封不严溢于容器外，
或容器外粘有样品而造成相互间交叉污染；
样品核酸模板在提取过 程中，
由于
移液器
污染导致样品间污染；
有些微生物样品尤其是病毒可随气溶 胶或形成气溶胶而扩
散，导致彼此间的污染。

②

PCR
试剂的污染。主要是由于在
PCR
试剂配制过程中，由于
移液器
、
容 器、
双蒸水
及其它溶液被
PCR
核酸模板污染。

③

PCR
扩增产物污染。这是
PCR
反应中最主要最常见 的污染问题，因为
PCR
产物拷
贝量大，远远高于
PCR
检测数个拷 贝的极限，所以极微量的
PCR
产物污染，就可造成假阳
性。还有一种容易忽视，最可 能造成
PCR
产物污染的形式是气溶胶污染在空气与液体面摩
擦时就可形成气溶胶，< br>在操作时比较剧烈地摇动反应管，
开盖时、
吸样时及污染
移液器
的反< br>复吸样都可形成气溶胶而污染。

④

实验室中克隆质粒的污染。在分 子生物学实验室及某些用克隆质粒做阳性对照的检
验室，
这个问题也比较常见，
因为克 隆质粒在单位容积内含量相当高，
另外在纯化过程中需
用较多的用具及试剂，
而且在活 细胞内的质粒，
由于活细胞的生长繁殖的简便性及具有很强
的生命力，其污染可能性也很大。< br>
为了避免因污染而造成的假阳性，
PCR
操作时采取如下措施：

①

合理分隔实验室。将样品的处理、配制
PCR
反应液、
PCR
循环扩增及
PCR
产物的
鉴定等步骤分区或分室进行，
特别注 意样本处理及
PCR
产物的鉴定应与其它步骤严格分开，
最好能划分①标本处理区；< br>②
PCR
反应液制备区；
③
PCR
循环扩增区；
④< br>PCR
产物鉴定区。




②

移液器
：
移液器
污染是一个值得注意的问题，由于操作时不慎将样品或模板核酸吸入
移液器
内或粘上枪头是一个严重的污染源，
因而加样或吸取模板核酸时要十分小 心，
吸样
要慢，吸样时尽量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或产生气溶胶污染。




③

预混和分装
PCR
试剂： 所有的
PCR
试剂都应小量分装，如有可能，
PCR
反应液应
预先配 制好，然后小量分装，
-20
℃保存，以减少重复加样次数，避免污染机会。另外，
P CR
试剂与反应液应与样品及
PCR
产物分开保存，不应放于同一冰盒或同一冰箱。< br>



④

防止操作人员污染，
手套、吸头、小离心管应一次性使用。




⑤

设立适当的阳性对照和阴性对照，阳性对照以能出现扩增条带的最低量 的标准核酸
为宜，
并注意交叉污染的可能性，
每次反应都应有一管不加模板的试剂对照 及相应不含有被
扩增核酸的样品作阴性对照。




⑥

减少
PCR
循环次数，只要
PCR
产物达到检 测水平就适可而止。




⑦

选择质量好的< br>Eppendorf
管，以避免样本外溢及外来核酸的进入，打开离心管前应
先离心，将 管壁及管盖上的液体甩至管底部，开管动作要轻，以防管内液体溅出。

2.
注意个人防护和环境保护，电泳中用到的
EB
（
Times New Roman
体）
可诱发基因突
变，试验中被
EB
污染的物品 要有专用收集处，并通过焚烧作无害化处理。

3.
实验用品应专用，实验前应将实验 室用紫外线照射以破坏残留的
DNA
或
RNA
。

总而言之 ，
PCR
的条件是随
系统而异的
，并无统一的最佳条件，先选用通用的条件扩
增，
然后可以通过稍稍改变各参数，使反应条件得到优化，
以取得优良的特异性和产率 。

【实验报告】

1.
实验结果

（
1
）
你所做的
PCR
实验阳性对照是否出现相应扩增带
?
如果有扩增带，
请对你的试验结
果进行描述。如果失败，请分析其原因。

2.
思考题

（
1
）
PCR
技术的基本原理？

（
2
）影响
PCR
实验成功的因素有哪些？

（
3
）
PCR
检测中出现假阳性，可能导致的因素有哪些？

（
4
）根据实验过程
中
的体会，总结如何做好
PCR
实验？关键因素有哪些？





实验
2 RT-PCR
检测猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸


【目的要求】


通过本实验使学生初步了解和熟悉病毒核酸
（
RNA
）
的 分离与
RT- PCR
技术的基本原理、
操作
方法
、影响因素和应用。

【基本原理】

猪繁殖与呼吸综合征
(
Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome, PRRS
)
是由猪繁
殖与呼吸综合征病毒
(
Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus, PRRSV
)
引起的
一种传染病
,
其临诊特征为各种年龄的猪均可感染
,
病猪厌食、嗜睡、体温升高
,
妊娠母猪发
生早产、流产、死胎、弱胎和木乃 伊胎
,
种公猪性功能下降
,
仔猪和育肥猪呼吸障碍。
1987
年该病首次报道于美国
,
随后迅速蔓延北美、欧洲及亚洲各国
,
目前已成为 一种地方性流行
病。
1996
年初
,
我国也报道了本病的发生。由于
PRRS
与其它引起猪繁殖障碍的疾病存在着非
常类似的临诊症状
,
根据现场诊断很难做出准确鉴别。
实验室诊断方面
,
如病毒的分离与鉴定,
抗原及抗体的检测等方法或特异性、
敏感性差
,
或操作技术复杂、费时费力等缺点
,
不能满足
临床
需要。
PRRSV
属动 脉炎病毒科成员，有囊膜，基因组为单股正链
RNA
，大小约
15kb
。反转 录
-
聚合酶链式反应（
Reverse Transcript- Polymerase Chain Reaction
，
RT-PCR
）
方 法具有特异、敏感、快速诊断等优点，因此
PRRSV
适用
RT- PCR
方法进行检测。

RT-PCR
是体外酶促合成特异
DNA< br>片段的一种方法，
它是以
RNA
为
模
板，
根据碱基配
对原则，按照
RNA
的核苷酸顺序合成
DNA
。这一过程与一般遗传 信息流转录的方向相反，
故称为反转录，催化此过程的
DNA
聚合酶叫做反转录酶(reverse transcriptase)
。基本过程是
以
dNTP为底物，
以
RNA
为模板，
按
5
’
→
3
’
方向，
合成一条与
RNA
模板互补的
DNA
单 链，
这条
DNA
单链叫做互补
DNA(complementary DNA, cDNA)
，
它与
RNA
模板形成
RNA-DNA
杂交体。
随后又在反转录酶的作用下，
水解掉
RNA
链，
再以cDNA
为模板合成第二条
DNA
链。至此，完成由
RNA
指导 的
DNA
合成
(
图
23-2)
，然后将
DNA进行
PCR
扩增。
PCR
扩
增的基本原理见实验
1部分。













图
23-2 RT- PCR
基本原理示意图


【器材准备】

1
.
TRIzol LS Reagent RNA
提取试剂。

2
.
氯仿、异丙醇、
70%
乙醇。

3
.
DEPC
处理水：按
1
∶
1000
的比例将
DEP C
加入三蒸水，室温放置
12h
以上。

4
.
5
×反转录反应缓冲液。

5
.
Su perScript
TM
Ⅱ反转录酶（
200U/
μ
L
）< br>。

6
.
RNA
酶抑制剂
(40U/
μL)
。

7
.
2.5 mM dNTPs
：含
dA
TP
、
dCTP
、
dGTP
、
dTTP
各
2.5 mM
。




8
.
10
×
PCR Buffe
r
、
Taq DNA
聚合酶。

9
.
DNA
分子量标准。

10
.
上样缓 冲液：
2.5g/L
溴酚蓝、
400g/L
蔗糖水溶液。
10mg/ ml
溴乙锭
(
EB
)(
具致癌性，
操作时应戴手套
)
，琼脂糖。

11
.
50×
TAE
：
242g Tris
，
57.1mL
冰乙酸，
100mL 0.5mol/L EDT A
（
pH8.0
）加三蒸水定
容到
1000mL
。使用液为
1×
。

12
.
PRRSV
标准毒株、
PRRSV-RNA
可疑组织样品、
PRRSV- RNA
阴性组织样品等。

13
.
引物：

（
1
）反转录引物：可用随机引物（
Random
Primers
）
（市售）
、
Oligo
（
dT
）
12- 18
（市售）
或
Random Primers
与
Oligo
（
dT
）按
3
：
1
混合而成的引物
Oligo< br>（
dT
）
/Random primer
，或
用相对
PRRSV RNA
来说的
PCR
下游单侧特异性引物。

（
2
）
PCR
引物序列：以高度保守的
ORF7
作为
扩增靶区
设 计并
合成一
对引物，序
列
如
下
：
引
物F
：
5-ATGCCAAATAACAACGGCAAG
C
；
引
物
R
：
5-TTAATTTGCACCCTGACTG-3
。

14
.
仪器：台式高速离心机、
PCR
扩增仪、电泳仪、水平式 电泳槽、紫外透射反射分析