脐带血细胞建库文献综述2011

2021年1月24日发(作者：黄泽)
脐带造血干细胞建库文献综述

一、脐带造血干细胞库建立的意义

动物的体细胞、
生殖细胞
（精子和卵）以及受精卵或发育早期的胚胎，
经甘油或二甲基
亚砜等抗冻剂，处理，按预定速率降温，然后就可以长期冻存于

-196
℃

的液氮中。在需要
的时候，再解冻或复温，细胞又可“ 复苏”
，重新开始生长繁殖。从事细胞的培养、冻存、
特征化以及质量和污染控制的机构就叫做 细胞库。
狭义上，
当保存的该物种的个体达到一定
的样本含量（通常
n
≧
30
）时，便称之为该物种的细胞库。

造血干细胞
(hematopoietic
stem
cell
，
HSC)
具有高度的自我更新、多向分化以及损伤后
修复的能力。干细胞的研究和应用 ，是
21
世纪生命科学研究的热点，该领域的重大进展，
不仅逐渐揭示了生命起源和人 体发育衰老的奥秘，而且极大地改变了现代医学的面貌。

造血干细胞的保存是干细胞移植中的 重要环节。
造血干细胞的移植是治疗血液系统恶性
肿瘤、部分遗传性疾病和实体瘤的良好方法。 据
Brunstein
等的统计，尽管目前骨髓库中有
700
万志愿者，但是 仍然有
1/3
的患者无法找到合适配型，这在客观上要求和促进了脐带血
库的快速建设 及国际间的合作。
2005
年末，美国通过《
2005
年干细胞治疗与研究法 案》
，为
脐带血干细胞研究和应用提供约
8
千万美元资金，

以便在
5
年内建立一个储存数目达到
15
万份的国家脐带血库网络，
这在一定意义上也说明脐带血的重大意义及建设脐带血库的必要
性正被人们逐渐认识和肯定。

脐带血是指婴儿分娩后，
残留在脐带和胎盘绒毛血管内的血液，
含有丰富的较原始的造
血干细胞，早在上世纪
30
年代，临床已开始倡导脐带血治疗。
60
年代人们发现胎鼠外周血
造血干
/
祖细胞数明显高于新生鼠外周血。
1974
年
Kundtozn
等首先报告以半固体琼脂培养发
现人脐血粒单系集落形成 单位
C(Fu
一
GM)
产率
(17~385/2
×
10
5
)
明显高于成人外周血
(0~11/2
×
10
5
)
。培养
14
天后，每个集落细胞数波动在
1000
—
1500
。
80
年代初，
Borxmyeer
对人脐
血造血干
/
祖细胞进行了大量体外集落形成实验，肯定了脐血中含有大量的多潜能造血祖细< br>胞
(cFU
一
GEMM)
、
红系爆增型祖细胞
B(F U
一
E)
、
CFU
一
GM
和巨核祖细胞
C (FU
一
Mge)
。
在此基础上，
Edwardt
和
Borxmyeer
共同提出了脐带血造血干细胞可能作为人的骨髓造血重
建的一个重要来源 的设想。进而
Gluckmna
和
Brxomyeer
合作在临床上做了一定 的尝试。利
用脐血造血干细胞移植
C(BSCT)
成功地治疗了
2
例
Fnaocni
、贫血。目前，脐带血作为外周
血和骨髓外一个极有潜力的造血干细胞 来源，
越来越引起实验血液学家、
临床血液学家、
肿
瘤学家、分子生物学家等 的关注。

脐带血干细胞是指将没有经病毒和细菌污染的脐带血，
经过抗凝处理，用分离液分离出
的造血干细胞。

二、脐带造血干细胞库建立的方法
< br>建立细胞库的基本流程包括：细胞的采集、细胞的培养、传代培养、细胞冻存、细胞复
苏、
检测细胞特征因子、
细胞的形态观察比较、
对于细胞病原体检测、
组织相容性抗原< br>(HLA)
配型
、
以及对建库过程中的污染检测。

2.1
细胞的采集分离

2.1.1
脐带血的采集
< br>对脐血供应者
(
包括母亲和婴儿
)
有以下要求
:
①母 亲必须无遗传病家族史，
无输血史，
无
器质性疾病及恶性肿瘤史，无肝炎、
梅 毒、
艾滋病等急慢性传染病的证据，无妊娠合并症及
妊娠期间药物服用史以及羊水检查未发现异 样等。
②婴儿必须足月经阴道或剖腹产分娩且分
娩时间少于
24
小时，体重大 于
2500g
，
APGAR
评分不少于
8
分，以及无先天性 畸形等。脐
血在胎盘娩出前或娩出后清洁状态下均可采集。
前者采集量大，
脐血不易凝 结，
需要在助产
士帮助下完成
;
后者采集量小，易发生凝血，可由脐血库专职 工作人员采集。采集方法如下
:
新生儿娩出后，立即在距脐
5
一
7c m
处结扎脐带并切断，消毒脐带侧，选择较粗脐静脉穿
刺，脐带
(
胎盘
)
血借宫缩力流入采血袋
(
含无菌肝素
)
内，摇匀取少许脐血样本 进行生物学检
测、
病原体检测、
血型和
HLA
分型及遗传疾病检测。
脐带血可以在
4
℃

冰箱中保存
2-3
天。

2.1.2
脐带血细胞的分离

由于脐血中含有丰富的造血干细胞，
同时又有着比骨髓和 外周血便捷的移植优势，
因此
脐血已经成为造血干细胞的一个新的更重要的来源。尽管每份脐血 平均采集量只有
100ml
左右，
但由于脐血的冷冻保存及平时维持费用昂贵，
因而很有必要从脐血中去除红细胞、
血
小板和血浆，收集主要富含脐血干
/
祖细胞的单个核细胞
(Mono
一
Nuclaeetcell
，
MN C)
，通
过分离达到缩小脐血的保存体积，
降低冻存成本，
同时，
可 以满足实际移植时高浓度细胞的
需要。

脐带血造血干细胞的浓集常用密度梯度离心法 进行分离。
单纯离心分离、
白膜分离、
不
同密度梯度离心分离均有造成祖细胞 的丢失，
CFU
一
GM
的回收率为
16%~60%
。但为了 减
少脐血体积和便于保存，以及减弱用脐血进行移植时供体与受体
ABO
血型不相容而 带来的
反应，
人们正致力于摸索适合于脐带血干细胞的分离方法。
张洪泉等用
6%
羟乙基淀粉
(HES)
沉降红细胞分离脐带血干细胞，有核细胞回收率平均达92%
。
Phawa
等用
3%
明胶沉淀法去
除红细胞回 收
88%
一
94%
造血干
/
祖细胞。
Newton
等则用
PerocH(
比重
11080)
分离液分离脐
带血 干细胞，
分离后
CFu
一
GM
形成数为分离前的
93.5%
，
Falkneburg
等进行了更深入的研
究，他们用多种方法如红细胞溶 解、甲基纤维素沉淀红细胞、
FiocH
、
PerocH
不同密度液离
心分离脐血与骨髓，结果脐血与骨髓细胞的回收率相近似
(
脐血在采集后
8
小时内分离，就
不会造成干细胞的大量丢失
)
。但是，
Borxmycer< br>总结了脐血造血干细胞的基础研究和临床
移植经验，
认为在脐血收集和分离以及低温保存 过程中，
为尽量减少造血细胞的丢失，
应推
荐不分离而作全血冻存，
复温后亦 不洗脱细胞保护剂直接输注。
因为任何形式的造血细胞分
离、溶解红细胞和洗脱细胞保护剂的措 施均会增加造血细胞的大量丢失，有时丢失率高达
50%
一
90%
，这样会大 大降低脐血移植成功的机率和临床治疗效果。

密度梯度离心法步骤：

(1 )
脐血的分离采用密度为
1.077g/ml
的
Ficoll(pharma cia
公司
)
分离液进行密度梯度离心
分离。首先，根据所采脐血的体积，准 备
14ml
离心管若干，在每根离心管中加入
Ficoll
分
离液各
4ml
。

(2)
在无菌条件下用针管将含有抗凝剂的脐带血抽出，
均匀的分加入含有
Ficoll
分离液的
离心管中，细胞悬液轻轻铺在分离液 上面，形成两种色泽的界面，
Fiocll
分离液与脐带血的
比例在
1:1< br>和
1:2
之间即可。

(3)
将离心管对称放入水平离心机中 ，
以
2500r/min
的离心速度离心
25min
后取出，
离心
管中的液体将分层，
离心后可见单个核细胞呈白膜状于分离液上，
将吸管轻轻伸 入中间的白
膜层，将白膜层缓慢吸出后
(
尽量少带分离液
)
注入新的 离心管中。

(4)
在
新的离心管中加入含
有
10%胎牛
血清
(Sgima
公
司
)
的
Hnaks< br>平衡盐溶
液
HBSS(Hank
’
S
Balanced
salt
solution
，
Gibco
公司
)
对细胞进行混合洗涤，混合均匀后以
1000r/min
的离心速度离心
5min，重复这一过程两次，将离心好的细胞按照所需的密度进行
调整并接种到培养瓶中，之后将培养瓶放 入培养箱中备用。

实验主要仪器：


2.2
细胞的培养

苏维祥等人研究发现低糖
DMEM+
干细胞因子组和
MesenculTM (
一种特殊成分的液体
培养基，与其添加物配合使用可促进间充质干细胞分化为脂肪细胞
)
组细胞生长旺盛，在培
养过程中对细胞的形态进行观察，并记录细胞的生长曲线，鉴定细胞 的特征。

脐带血有核细胞在
MSCGM
中进行初步培养
,
细胞密度为
1
×
10
6
～
10
7
/ cm
2

。
5 d
后更
换培养基
,
清除非黏附细胞
,
以后每周更换
1
次
50%
培养基。细胞在添加
0 .25%
的胰岛素和
1mmol / L
的
EDTA
的培养基中迅速生长。当细胞达到
60 %
～
70 %
汇合时
,
将培养基中的细
胞密度调至
1000
～
2000/ cm
2

。用相差显微镜观察黏附细胞的结构。

2.2.1
细胞生长曲线的绘制

(1)
取生长状况良好的细胞作为测定样品，胰酶消化 吹打，使细胞悬浮，将细胞混合均
匀。

(2)
测定细胞浓度。

(3)
加入新鲜培养基调整细胞浓度。

(4)
将细胞悬液每孔1ml
（体积按照接种的孔板大小而定）
，分装在
24
个培养板的孔中，
给每三个孔编号，
1~8
号。

(5)
细胞于
37
℃恒温培养。从此时算起（算作第
0
天，并记录初始密度）
，用细胞活力分< br>析仪按编号每隔
24
小时测定三孔的细胞，
其中的数据包括：细胞成活率、细胞 密度、活细胞
数、死细胞数、细胞平均直径、细胞平均圆度。

(6)
如果测 得的数据在
8
天内没有形成曲线，可以连续循环测下去，直至形成完整的生长
曲线。< br>以每天的细胞密度大小为纵坐标，
天数为横坐标，
绘制细胞生长曲线
（活细胞与 死细
胞密度曲线可绘制于同一图中，以便观察）
。

说明：在分装细胞悬液时 要注意，在每加一次前，要轻轻吹打
2~3
次，以使细胞悬液混
合均匀。

2.3
传代培养

培养的细胞，通过换液弃去悬浮死亡的细胞，待贴壁细胞长 满
60%
左右，
1
：
1
传代，待
细胞长满
80-90%
，
1
：
3
传代，同时检测细胞的生长特性如做生长曲线 、倍增时间、观察细
胞形态等。

2.3.1
细胞倍增时间

细胞指数生长期可用细胞倍增时间（
Population Doubling Time,PDT
）来衡量。

计算步骤：

[1]
绘制细胞的生长曲线。

[2]
在曲线上确定出细胞的指数生 长期所对应的曲线，在此曲线上任意两点都可根据以
下公式求得其倍增时间：

PDT =
（
t-t
0
）
log2/
（
logN- logN
0
）


其中，
t
0
和
t
为所选的两个时间，且
t
0
要小于
t
，单位可用天或小时
N
0
和
N
是
t
0
和
t
所 对应的
活细胞密度，单位是个
/ml
。

结果：
根据公式便 可计算出细胞进入指数生长期后，
前代细胞分裂形成下代细胞所用的
时间，单位可用天或小时。

2.3.2
细胞大小测定

显微测微尺
（即测微尺）< br>是用来测定显微镜下被镜检物的长度、
面积和体积大小的量具。
分为镜台测微尺
（计）
和目镜测微尺
（计）
两种，
用时必须两者互相配合，
才能完成 其效用。
镜台测微尺为一种特制的载玻片，其中央胶粘一小圆形玻片。每刻度为
1mm
，划分为
10
大
格，每一个又分为
10
小格，共
100小格，每小格为
0.01mm
（
10
μ
m
）
。 目镜测微尺是放入目
境内光圈板上的一种圆形玻片。
上面刻有刻度标尺，
有的为直线式 标尺，
有的为多格式的网
状测微尺。测量长度时用直线式测微尺，测数目和物体面积时用网式测 微尺。

测量步骤：

(1)
确定使用有推动器的显微镜，记下号码与使用倍率。

(2)
将物镜对准载物台上的圆孔，并使光线在视野中照射均匀，强弱适中。

(3)
取镜台测尺将中心置于圆孔中心位置进行调焦，使测微尺上的刻线清楚，无双影。
< br>(4)
将目镜的接目镜片（目镜上盖）取下，再将目镜测微尺放于目镜光阑上（注意有刻
度的一面向镜台下方）
，然后旋上接目镜片，在将目镜装回镜筒中即可开始测量。

物体长度测量方法：

(1)
求出待测物体的长度为目镜测微尺多少小格，以
A
表示。
< br>(2)
求出目镜测微尺每一小格的长度（
μ
m
）
，以
B
表示，即

B=
台尺格数×
10
μ
m/
目镜测尺格数

注意：台尺格数及目尺格数是以两尺重叠在一起时的各自格数。





下表实验中所用显微镜目镜测微尺每一小格的长度

Table The length of every unit for the microscope ocular micrometer

目镜倍数

物镜倍数

台尺格数

目镜测尺格数

目镜测微尺每一小格的长度
B
（
μ
m
）

倒置显微镜

10
倍

25
倍

17
格

50
格

3.4
μm

正置显微镜

10
倍

40
倍

6
格

20
格

3μm

(3)
求出所测物体的长度（
μ
m
）
，以
C
表示，即C=A
×
B
。

2.4
细胞冻存

张 绍志等测量了脐带血干细胞对水和二甲亚砜的渗透性，
观察了脐带血干细胞在冷冻过
程中的结冰 现象。
利用这些数据，
对在二甲亚砜保护下的脐带血干细胞的冷冻过程进行理论
优化， 并与实验结果进行对比，发现
10%DMSO
，冷却速率大于
5
℃
/ min
的条件对于细胞的
冻存损伤最小，骨髓、外周血、脐带血等造血细胞移植越来越普及，对 其应用何种保护剂、
如何降温、保存、复温等，报道不一。根据保存效果好、省时、省力、经济、方便的 原则，
在保存造血细胞时，推荐使用

5% DMSO
，
6% HES
为保护剂，一
80
℃冰箱降温
24 h
后，液
氮液态或气态保存。

目前，
脐血造血干细胞的保存主要是 采用传统的慢速冻存的方法，
尽管这一方法已取得
了不错的保存效果，但慢速冻存法也有诸多弊 端，例如
:
在慢速降温过程中，冰晶对细胞的
损伤是不可避免的，
这对于长期 保存细胞的质量和数量都是极为不利的，
同时，
慢速降温对
设备的要求比较复杂，设备的昂贵和操作的繁琐，
也增加了造血干细胞保存的费用。
玻璃化
冻存法作为一 种新的，
有效的冷冻保存方法，
可以彻底阻止冰晶的形成，
达到永久保存细胞
的目的，
而且玻璃化法
（玻璃化法又称之为无冰晶技术，
即通过提高冷却速率或增加溶 液浓
度的措施使冷冻保护剂溶液实现玻璃化，
Luyet
认为，生命可归结于“原子和 其他一些生命
单元的专门而异常的排列”
，
并且
“轻微的排列位置的扰动就会 破坏平衡从而导致死亡”
，
而
结冰时的驱动力会破坏这种特殊的“排列”
，这 就是冰冻死亡的原因，玻璃化比冻结固化方
法引起的结构变化要小，
因而是一种更理想的低温保 存途径）
操作简单方便，
不需要昂贵的
设备，因此有望在脐血干细胞的长期保存方面展 现良好的应用前景。

有许多有关冻存保护剂的报告，用
HES
，
D MSO
和白蛋白等，在液氮深低温内贮存细胞
经贮存
7
—
11
年的脐带血细胞均无明显的细胞活性变化

。
也有人提出长期保存的脐带血，
较
不经冻存的脐带血中
CD34
细胞减少约
1
／
3(20
％对
45
％
)< br>，但原始的造血干细胞
(primitive
sierl cells)
并不受影响

。有人提出加与不加
HES
以及
10
％或
5
％

DMSO
对冻存的细胞活性均
无影 响，
但有一点可以肯定即冻存的
CD34
细胞活性和程控降温速度有非常密切的关系 ，
一
般均采用
1
℃／分钟降温，而且
DMSO
终浓度不应低 于
5
％。

众多的研究已证明目前的操作程序是完全适台脐带血造血干细胞长 期保存，
同时也可用
于脐带血造血干细胞的体外扩增。
尽管脐带血干／祖细胞扩增还仍 处于体外试验阶段，
但已
有脐带血库把同一份脐带血分成
2
袋储存，以方便用 于以后的体外扩增。目前，对造血干／
祖细胞扩增有
2
种方法，一种是采取脐带血细胞 和基质细胞共同培养。另一种是通过
FL(Fit
一
3
受体
)
，Ⅱ

SCF
，
EPO
，
IL-3
，
G M
—
CSF
和
G-CSF
等细胞因子的不同组合扩增脐带血干／