免疫组化原理和步骤

2021年1月23日发(作者：唐铎)
免疫组化原理及步骤

免疫组化操作规程



一、实验原理与意义


免疫组织化学又称免疫细胞化学，
是指带显 色剂标记的特异性抗体在
组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，
对相应抗原< br>进行定性、定位、定量测定的一项新技术。它把免疫反应的特异性、
组织化学的可见性巧妙地结合 起来，借助显微镜
(
包括荧光显微镜、
电子显微镜
)
的显像和放大作 用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原
物质
(
如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及 受体等
)
。


二、实验器材


微波炉 、
吹风机、
组化笔、
湿盒、烤箱、
振荡器、
染缸、光学显微镜、纯木浆卫生纸、计时器和通风橱等。


三、试剂配制




1.


0.01 M PBS(pH 7.34 )
：
9.0 g NaCl + 50 ml 0.2 M PB
加双蒸
水至

1000 ml
；

1000 ml 0.2M PB (pH 7.4)
＝
5.93 g NaH 2 PO 4 ·
2H 2 O
＋
58.02 g
Na 2 HPO 4 ·
12H 2 O in 1000 ml
双蒸水或＝
190 ml A + 810 ml B
（
A. 0.2 M NaH 2 PO 4 ·
2H 2 O
：
15.6 g in 500 ml ddH 2 O
；
B. 0.2

M Na 2 HPO 4 ·
12H 2 O
：
71.632 g in 1000 ml dH 2 O
）。


2.


Citrate Buffered Saline
（
0.01 M
柠檬酸缓冲液，
PH6.0
）：
28
ml A + 72 ml B + 200 ml ddH 2 O
（
e acid
（柠檬酸）：
10.5 g

加双蒸水至

1000 ml
；
e sodium
（柠檬酸钠）：
29.41 g
加
双蒸水至

1000 ml
）。


3.


细胞通透液：由终浓度分别为

0.3%
双氧水和

0.5%Triton

X-100
混合而成。配制方法是先用微波加热的

36 ml PBS
，再接着
加

120 ul TritonX-100,
并加热一儿，
冷却至临用前加

0.4 ml 30
％
H 2
O 2
。


4.


5
％羊血清或封闭血清，用

PBS
稀释。


5.


含

0.03
％
H 2 O 2
的

0.05
％
DAB
（避光）
：
用

20×
DAB
（
1
％，
10 mg/ml
）
5 ul
＋
0.1 ul 30% H 2 O 2
＋
95 ul PBS
。


6.


一抗、二抗均用

PBS
稀释。


7.


Xylene
、
梯度

Ethanol
（
100
％
×
2
、
95
％、
80
％、
70
％、
50
％）
、
双蒸水、中性树胶（封裱剂）。


8.


苏木精染液：


四、操作步骤





1
、脱蜡、水化





1)


60
℃
×20 min→Xylene 2 ×10 minutes
；


2)


100% absolute ethanol
：
2 ×
5 minutes
；


3)


95% ethanol 2 minutes
；




4)


80% ethanol 2 minutes
；


5)


70% ethanol 2 minutes
；


6)


distilled water:5 min
；


7)


PBS
洗

3
次
×
3 min
。


2
、细胞通透、封闭内源性过氧化物酶


8)

用封闭通透液浸润切片

30 min
（
RT
避光）。配法是用预热

40
ml PBS
加

120ul TritonX-100
加热几分钟后，临用前加

400 ul
30
％
H 2 O 2
。


9)

PBS
溶液洗

3
次
×
3 min
。


3
、抗原修复暴露抗原决定族


10)

切片放入

0.01 M
柠檬酸钠缓冲溶液（
pH6.0
）后，在微波炉
里高火

4 min
至沸腾后，
再加热约

6 min×
4
次，
每次间隔补足液体，
防止干片。


4
、封闭非特异性蛋白




11)

PBS
溶液洗

3
次
×
3 min
；


12)

将切片取出
,
周 围水分用滤纸吸干
,
用组化笔在组织周围画上圈
,
在圆圈内组织滴入

5%
羊血清（与二抗来源一致）后放入湿盒中
,
室
温

30
（
10
～
30
）
min
；


5
、一抗孵育




13)

甩去切片上的羊血清
,
用滤纸擦干组织周围残留血清，直接加入
已 稀释的一抗（
1
：
250
、
500
、
1000）后，放入湿盒中室温

1
小时，
然后

4
度过夜，从冰箱中取出需
37
℃复温

45 min
。


6
、二抗孵育




14)

将一抗倒掉并用

PBS
洗

5 min×
5
次；


15)

用滤纸将圆圈周围的水吸去，
加入已稀释的二抗后放入

37

℃
恒温烤箱中

30

min
（回收）。