免疫荧光双标操作方法及注意事项

2021年1月23日发(作者：诸葛高)
在同一组织细胞标本上需要同时检测两种抗原时，需进行双重荧光染
色。
双重免疫荧光 标记法
(double immunofluorescence labeling method)
也分为直接法和间接法。

(1)
直接法双重免疫荧光标记： 将标记有两种不同荧光素的抗体
(
如抗
A
和抗
B
)
以适当比例混合，滴加在标本上孵育，然后洗去未结合的荧光
抗体，在荧光显微镜下分别选择两种相应的 激发滤片观察，
即可对两种
抗原进行定位和定量。直接法简便可靠，但灵敏度较低。

(2)
间接法双重免疫荧光标记：
用未标记的两种特异性第一抗体孵育组织
或 细胞，
洗去多余的第一抗体后，
再用两种不同的荧光素分别标记的第
二抗体孵育组织或 细胞，
洗去多余的第二抗体，后在荧光显微镜下分别
选择两种相应的激发滤片观察，从而对两种 抗原进行定位和定量。
使用
此法应注意两种特异性第一抗体必须来源于不同种属，
且荧 光标记第二
抗体的种属必须与第一抗体的种属相匹配。

免疫荧光双标技术中操作要点和注意事项

一、
免疫荧光技术中标本制作的基 本程序近似于酶免疫组化，
不同点如
下：


1
、免疫荧光不需要使用双氧水处理，封闭和一抗孵育与其相同。

2
、免疫荧光的二抗使用不同荧光标记的二抗孵育，孵育时间根据抗
体的工作浓度确定。< br>

3
、二抗孵育之后充分洗片后即可贴片、封片和观察。


4
、免疫荧光在封片时常使用专用封片剂或甘油：
0.01M PBS (1
：
1)
。
条件许可，建议购买抗淬灭的封片液，使标本可以保存更久。< br>
5
、荧光抗体的孵育以及后续处理需要避光。

6
、荧光抗体染色假阳性可能会多，需要分别设定阳性和阴性对照。

二、注意事项


1
、荧光染色后一般在
1h
内 完成观察，或于
4
℃保存
4h
，时间过长，
可能会使荧光提前衰退。

2
、每次试验均需设置以下三种对照：


(1)
阳性对照：阳性血清
+
荧光标记物
;

(2)
阴性对照：阴性血清
+
荧光标记物
;

(3)
荧光标记物对照：
PBS+
荧光标记物。

三、免疫荧光双标的经验之谈

1
、选取一抗时，要求来源于两种不同的 动物，我用的是来源于家兔和
大
鼠
的
抗
体
，二
抗则
是
不
同
荧
光信
号标
记
的
，
我
用的是
donkey
anti-rabbit- FITC(
绿
)
和
donkey anti-rat-Tex- Red(
红
)
。

2
、
我的做法是两种一抗同 时孵育，
然后两种二抗同时孵育。
抗体浓度、
孵育时间要自我摸索，
我感觉一 抗
4
℃孵育过夜比较好，
背景比较清晰。

3
、
我的阳性对照采用的是阳性组织切片，
阴性对照则分别是家兔和大
鼠的
IgG
，荧光标记物对照是
PBS+
荧光标记物。

4
、封闭血清是 二抗来源动物的正常血清，我用的是
10%
正常
donkey
血清。

5
、其余事项同免疫荧光单标操作。

免疫组化双重染色方法和步骤

在生物医学和临床研究实践中，
经常需要检测两种不同物质是否在同一