Elisa技术原理和相关概念全整理

2021年1月23日发(作者：褚君浩)
一、免疫分析技术基本原理

利用抗原、抗体之间的特异性结合来测定、分析特定物质的方法

抗原：可诱导动物免 疫系统产生免疫应答的物质。按其引起免疫应答的能力分半抗原、抗原、超抗原。

抗体：由动 物免疫系统产生，可特异性结合某种物质的免疫球蛋白。分
IgG
、

IgM
、

IgE
、

IgA
、

IgD
五个亚型。不同亚型针对同一抗原表位的结合位点的结构相同。不同亚型出现的先后顺序 不同，在血清中的
含量不同，在机体中出现的地点不同。


抗原抗体反应的特性

1
、可逆性


抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一种动态平衡，其反应式为：

Ag + Ab
→

Ag·
Ab
抗体的亲和力
（
affi nity
）
，
可以用平衡常数
K
表示：
K=[Ag·
Ab]
／
[Ag][Ab]
，
Ag·
Ab
的解离程度与
K
值有
关。高亲和力抗体的抗原结合点与抗原的决定簇在空间构型上非常适合，两者结 合牢固，不易解离。解离后
的抗原或抗体均能保持原有的结构和活性

2
、特异性


抗原抗体的结合发生在抗原的决定簇与抗体的结合位 点之间。化学结构和空间构型互补关系，具有高度
的特异性。测定某一特定的物质，而不需先分离待检物 。

3
、最适比例



4
、敏感性

化学比色法的敏感度为
mg/ml
水平。

酶反应测定法的敏感度约为
5-10
μ
g/ml
。

免疫测定中凝胶扩散法和浊度法的敏感度与酶反应法相仿。

酶联免疫敏感度可高达
pg-ng /ml
水平。例如，
HBsAg
，其敏感度可达
0.1ng/ml
。

二、固相免疫测定的原理
< br>基础：抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，< br>产物的量与标本中受检物质的量直接相关，由此进行定性或定量分析。

双抗体夹心法

此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如
HBsAg< br>、
HBeAg
、
AFP
等。只要获得针对受检抗原的异
性抗体 ，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。

双抗原夹心法

用特 异性抗原进行包被和制备酶结合物。此法中受检标本不需稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相
对高于 间接法。乙肝标志物中抗
HBsAg
的检测常采用本法。本法关键在于酶标抗原的制备，应根据 抗原结构
的不同，寻找合适的标记方法。

间接法

间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。

竞争法

小分子抗原或半抗原缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此不能用双抗体夹 心法进行测定，可以采用
竞争法模式。其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。 标本中抗原量含量愈多，结
合在固相上的酶标抗原愈少，最后的显色也愈浅。小分子激素、药物等
ELISA
测定多用此法。

俘获法

IgM
的检测常用 于传染病的诊断。用抗人
IgM
抗体包被固相，以捕获血清标本中的
IgM
（ 其中包括针对
抗原的特异性
IgM
抗体和非特异性的
IgM
）
。此法常用于病毒性感染的早期诊断。

生物素－亲合素法

①固相支持物 →②固相化抗原→③特异性
IgG
（待检物）→④生物素化抗小鼠
IgG
（< br>Biotin
）→⑤
HRP-
酶
标链亲和素（
Avidin< br>）→⑥底物及显色剂→⑦显色和测定。

三、免疫检测相关概念

1
、样本、标本、临床标本

样本：在统计里，

我们把所要考察对象的全体叫做总体，

其中每一个考察对象叫做个体，
< br>从整体中所
抽取的一部分个体叫做总体的一个样本。样本是一个统计学的概念，样本往往不只包含 一个个体。

标本
（
Sample
，
S
）
：
在给定的考察或测量方法中的具体测量对象，
往往和统计学的个体等价。
例如在ELISA
实验里，
HCG
有测血样的也有测尿样的，对应的血样或尿样叫这个测 量方法的标本。

临床标本：在检验技术中，直接从机体采集的，经过处理而适用于临床检验的 标本。例如从人体采集的
抗凝血清叫临床标本，而经过稀释或浓缩的标本只能称为稀释标本或浓缩标本而 不能称之为临床标本。

2
、医学决定水平

医学决定水平（
Medicine decide level
，
MDL< br>）
：是指不同于参考值的另一些限值，通过观察测定值是否
高于或低于这些限值，可在疾 病诊断中起排除或确认的作用，或对某些疾病进行分级或分类，或对预后作出
估计，以提示医师在临床上 应采取何种处理方式，如进一步进行某一方面的检查，或决定采取某种治疗措施
等。随着检测技术的进步 ，某一检测指标检测灵敏度的提高，临床意义的改变，往往能改变某一疾病的医学
决定水平。例如某些激 素项目的超敏试剂盒能帮助医师判定疾病的进程及处理对策。

3
、金标准

金标准：现有条件下最科学最准确的标准。在检验学中指的是某种疾病标志物的确证实验。如菌体培养，
组织切片，组织活检，抗体条带免疫印迹（
WB
）
，核酸诊断等。

ELISA
方法往往只检验某种疾病众多表征或标志物中最具代表性或最具操作性的一种或几种 ，即通常所
说的初筛实验，追求的是灵敏、简便和快速，而这些表征或标志物的检出不能确证患病与否， 所以需要更进
一步的确证实验。

4
、对照实验

对照实验（
control experiment
）
：一般进行某种实验以 阐明一定因于对一个对象的影响和处理效应或其意
义时，除了对试验所要求研究的因子或操作处理外，其 他因素都保持一致，并把试验的结果进行比较，这种
试验称为对照试验。目的是通过对比实验的结果找到 想要研究的因素对实验的影响作用，从而为科学的研究
提供事实依据和直接证据。对照实验有对照组和实 验组。

有以下常见的类型：

1
）
、空白对照：即不作任何实验处理的对照组。

2
）< br>、自身对照：即实验与对照在同一对象上进行，不另设对照组（通常意义上的重复）
。

3
）
、条件对照：即给对象施以某种实验处理，但这种处理不是实验假设所给定的实验 变量。例如我们通
常在进行配方改进的时候，所改变的条件相对于原来的配方来说就属于条件按对照。< br>
空白（
blank
，
BL
）

空白实验（
blank test
）和空白样品：空白试验指对不含待测物质的样品， 用与实际样品同样的操作进行
的试验。对应的样品称为空白样品（简称：空白）
。


现场空白和实验室空白：现场空白指带到监测现场而模拟现场监测过程的空白样品。实验室空 白指没有
带到监测现场的空白样品。


标准空白、试剂空白和全程空白：标 准空白是指配标准溶液（标准系列溶液）时“零”浓度的空白，或
不添加标准物质的空白。试剂空白是指 随同试样分析步骤的空白样品。全程空白即全程试剂空白，是指经历
试样分析全部步骤的空白样品。
5
、本底
/
非特异结合

本底（
backg round
）
：亦称背景，指某一测量方法中阴性样本的信号值或计数值。

非特异结合（
nonspecific bind
，
NSB
）
：由非待检物产生的有用检测信号。表现形式为高本底阴性或阳性。

6
、阳性、阴性及界定

1
）
、阳性
/
假阳性

阳性（
posit ive
，
P
）
：在给定的某一判定标准下，某一测量结果符合存在条件的称为 阳性。例如
ELISA
实
验中规定，标本的测量结果大于界值判定为阳性。

假阳性：真实结果不满足存在的条件，由于某些因素的干扰，导致测量结果满足存在条件的称为假阳性。

在表述阳性或者假阳性时，测量方法、测量对象和适用范围一定要具体。例如，我们经常说某 人
HCV
阳
性，
严格的说这是一个不规范的说法。
因为可以理解为这 么多的意思：
此人是丙肝患者；
此人
HCV
抗原阳性；
此人
HCV
抗体阳性（可能是患者也可能不是患者）
；此人
HCV RNA
阳性等等。

2
）
、阴性
/
假阴性

阴性（
Negtive
，
N
）
：在给定的某一判定标准下， 某一结果不符合存在条件的称为阴性。

假阴性：真实结果满足存在的条件，由于某些因素的干 扰，导致测量结果不满足存在条件的称为假阴性。

在表述阴性和假阴性时，和表述阳性
/
假阳性一样，测量方法、测量对象和适用范围一定要具体。

7
、
CO
值

CO
值（
Cut Off Value
，

CO
）
：界值或阳性判定值，指某仪测量方法中用于 区分阳性和阴性的数值。有两
种判断方式：一种是大于
CO
值判为阳性，否则为阴性， 常见于
ELISA
实验中除竞争抑制法以外的方法，判
断方法较为直观；另一种是小于
CO
值判为阳性，否则为阴性，常见于
ELISA
实验中的竞争抑制法，判断 方
法不直观，要求测量方法稳定且重复性好。

CO
值的计算方式：往往以某 一常数加上或乘以一个变量，变量的变动范围较小，常数反映本底信号，变
量反映多次测量之间的差异。
例如，某公司
HIV
试剂盒
CO
值计算公式：
CO=NC+ 0.1
（
NC
＜
0.05
时按照
0.05
计算）< br>。

CO
值的设定：通常采用数理统计学的方法，即测量大量的阴性样本，测量 结果呈正态分布，取
95%
或
99%
为置信区，取置信区上限为
CO
值。

8
、
S/CO
值或
P/N
值

S/CO< br>值：即样本值和界值的比值，相当于一个半定量的判断。在
ELISA
检验中，
S/CO
值的判断方法比
将样本值和
CO
值直接比较更具科学性，
在 不同厂家试剂对比实验时往往用
S/CO
值而不是
OD
值。
做长期动
态的观察时
（例如做质控图）
，
用绝对的
OD
值做质控图不 能准确的反映实验环境给实验带来的影响，
而
S/CO
值则能尽量的减小这种影响。< br>
P/N
值：有两种说法，一种是标本值和阴性对照的比值，是早期采用的定性判断方法 ；另一种是患者测
量值（阳性值）和正常人测量值（阴性值）的比值。第二个个概念比较有用，它反应的 是试剂的阴阳反差，
即有用信号和背景信号的区分能力，一定程度上体现了试剂灵敏度的高低。

定性试验检测报告方式：
为便于统一计算，
国内外一般按
S/C.O
方式报告，
S
为标本
A
值，
C.O
即
Cut Off
值（阳性判定值
)

Cut Off
的计算公式以试剂盒说明书的为准常见的有：


C.O=2.1×< br>N
（当
N
不足
0.05
时按
0.05
计）< br>，此公式由
P/N>2.1
换算而来，常用于夹心法。


C.O=0.5×
N
，从抑止率公式换算而来，常用于竟争、中和法


C.O=N+C
（
C
为常数）
，用于间接法。


C.O=C×
P+N
（
C
为常数）
，用于间接法 。此公式最客观，但对生产厂家要求很高，阴阳性对照测定值要基
本恒定。


9
、标准品、校准品

标准品：

1
）
、 国际标准品：由
WHO
或相应组织标定的，用肯定的、公认的、准确的物理或化学方法测定的定 值
材料。如
FDA
的标准品。

2
）
、国际生物学 活性标准品：根据生物学反应，由
WHO
或相应组织标定的国际活性单位的材料。
< br>3
）
、参考标准血清：国家标准化组织根据国际标准化生产的法定材料。可用于鉴定仪器 和鉴定方法准确
性。如
HBsAg
的国家标准血清盘。

校准品：

使测量值具有可比性的对照物质。对于测量血清标本的检验手段来说，最佳 的校准品应该是用决定性方
法定值的新鲜混合血清。校准品具有系统专一性，不同系统的校准品不能混用 （例如不同厂家或者不同批次
的
“
标准品
”
不能替换使用）
。我们定量产品中通常所说的标准品严格以上来说应当叫校准品，校准品往上溯源
才是标准品。

ISO17511
对控制品有较为详细的说明。


10
、质控品
/
内控品

质控品（
control
）
：是已有靶值的对照物质，在每次的常规检验中加入一份或数份，通过所得结果来了解
本次检验的情况。质控品检验的结果如能控制其误差在一定范围内，就说明该检验没有发生不允许的误差。如果出现超过允许误差范围的异常结果，提示该检验不合格，应寻找原因，纠正后，重检待测标本。体外诊< br>断（
IVD
）
行业中，通常使用的质控品有卫生部临床检验中心
（NCCL
）提供的定值质控品。
在临床实验室中，
经常使用各省疾控中心（
CDC
）发放的定值质控品。各临床实验室每年还在第三方（通常由各省的相关领导
部门担任 ）的组织下进行室间质评，以评价实验室的总体检验水平。

内控品：参照权威机构标准品或质 控品，由实验室自己标定的对照物质，用于控制本实验室的实验误差。

质控品和内控品都要保证其溯源性！
！
！

11
、成品、半成品、中间品

成品：
通俗来说就是符合客户要求和 满足法律法规要求，
可以直接交货或售卖的产品。

比如试组装完毕、
检验合 格，贴上合格签的试剂盒。对于国家批批检的产品，必须还要有国家相关检验机构出具的合格检验报
告， 并经过相关机构做出合格标示的试剂盒才能算成品试剂盒。

成品与半成品是公司内对生产流程 的分类，可是对外，就没有什么成品和半成品之分了，如果客户要买
你的
“
半成品”
，那么
“
半成品
”
也就变成你们的成品了，如果客户不买你的
“
成品
”
，那么你的
“
成品
”
则连半成品
也不是！

所以我们一定要把东西卖出去。

半成品：通俗来说，品 质要求已达到客户要求，但还需要经过一道或几道后序加工程序才能成为成品的
产品，通常的后序加工程 序指的是组装。例如：检验合格的包被板，分装并检验合格的酶结合物和标准品等。


中间品：半成品生产过程中所处的合格的形态。例如：包被后检验合格的包被板，分装前检验合格的酶
结合物和标准品。

无论是成品、半成品还是中间品，必须强调检验合格的概念！

12
、质量检验

质量检验：对产品的一个或多个质量特性进行观察、测量、 试验，并将结果和规定的质量要求进行比较，
以确定每项质量特性合格情况的技术性检查活动。

质量检验的职能：鉴别、把关、预防、报告、监督。

质量检验的步骤



(1)
检验的准备。熟悉规定要求，选择检验方法，制定检验规范。在检 验的准备阶段，必要时要对检验人
员进行相关知识和技能的培训和考核，确认能否适应检验工作的需要。