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单克隆抗体的制备及应用

作者:陕西保健网
来源:http://www.xapfxb.com/yuer
更新日期:2021-01-23 18:44

广州甲亢医院-

2021年1月23日发(作者:高文进)
单克隆抗体的制备及应用





单克隆抗体< br>是由淋巴细胞杂交瘤产生的、只针对复合抗原分子上某一单个抗原决定簇。
单克隆抗体技术
(monoclonal antibody technique)
:一种免疫学技术,将产生抗体 的单个
B
淋巴细胞
同骨髓肿瘤细胞杂交,

获得既能产生抗体,

又能无限增殖的
杂种细胞
,并以此
生 产抗体。
是仅由一种类型的细胞制造出来的抗体,
对应于多克隆抗体、
多株抗体——由 多
种类型的细胞制造出来的一种抗体。


1
单克隆抗体的优点与局限性






1.1
单克隆抗体的优点:
(1)
杂交瘤可以在体外“永久”地存活并传代 ,只要不发生细胞
株的基因突变,就可以不断地生产高特异性、高均一性的抗体。
(2)
可以用相对不纯的抗原,
获得大量高度特异的、均一的抗体。
(3)
由于可能得到“ 无限量”的均一性抗体,所以适用
于以标记抗体为特点的免疫学分析方法,如
IRMA

ELISA
等。
(4)
由于单克隆抗体的高特
异性和单一生物学功 能,可用于体内的放射免疫显像和免疫导向治疗。





总体来说,即:
高特异性、高纯度、重复性好、敏感性强、成本低和可大量生产
等。





1.2
单克隆抗体的局限性:
(1)< br>单克隆抗体固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的应
用范围。
由于单克隆抗体不能进 行沉淀和凝集反应,
所以很多检测方法不能用单克隆抗体完
成。
(2)
单克隆 抗体的反应强度不如多克隆抗体。
(3)
制备技术复杂,而且费时费工,所以单
克隆抗 体的价格也较高。


2
单克隆抗体的制备:





单克隆抗体的制备原理
:应用细胞杂交技术使
骨髓瘤 细胞

免疫的淋巴细胞
二者合二
为一,得到杂种的骨髓瘤细胞。这种杂种细胞 继承两种亲代细胞的特性,它既具有
B
淋巴
细胞合成专一抗体的特性,
也有骨 髓瘤细胞能在体外培养增殖永存的特性,
用这种来源于单
个融合细胞培养增殖的细胞群,可制备 抗一种抗原决定簇的特异单克隆抗体。





单克隆抗 体的制备过程:
抗原准备、
动物的选择与免疫、
细胞融合、
选择杂交瘤细胞及
抗体检测、杂交瘤的克隆化、杂交瘤细胞的冻存与复苏、单克隆抗体的纯化等步骤。

2.1
抗原准备



抗原,
是指能够刺激机体 产生(特异性)
免疫应答,
并能与免疫应答产物抗体和致敏淋
巴细胞在体外结合,发生 免疫效应(特异性反应)的物质。抗原的基本特性有两种,一是诱
导免疫应答的能力,
也就是免 疫原性,二是与免疫应答的产物发生反应,也就是抗原性。很
多物质都可以成为抗原,
抗原的具 体分类可以参见抗原,
在进行单克隆抗体制备过程中,

多物质都可以成为抗原,在常 规的科研实验中,科研者经常选用每只小鼠
/
大鼠每次注射
10~50ug
重组蛋白、偶联多肽、偶联小分子等作为抗原产生特异性的单克隆抗体。


2.2
动物的选择与免疫

2.2.1
动物的选择



BALB/c
小鼠
,较温顺,离窝的活动范围小,体弱,食量及 排污较

开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种
小,一般环境洁净的实验室均能饲养成活
BALA/c
小鼠。



2.2.2
免疫方案


选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成 功,获得高质量的
McAb
至关重要。一般在融合前两
原的特性不同而定。




1
)可溶性抗原免疫原性较弱,一般要加佐剂,半抗原应先制 备免疫原,再加佐剂。
常用佐剂:
福氏完全佐剂、
福氏不完全佐剂。
初次免疫 抗原
1

50μg
加福氏完全佐剂皮下多
点注射或脾内注射(一般< br>0.8

1ml

0.2ml/
点)

3< br>周后第二次免疫,剂量同上,加福氏不完
全佐剂皮下或
ip
(腹腔内注射)
ip
剂量不宜超过
0.5ml


3
周后第 三次免疫,剂量同一,
不加佐剂,
ip

5

7
天 后采血测其效价)

2

3
周加强免疫,剂量
50

500μg
(静脉内注射
)

3
天后

取脾融合。




2
)颗粒抗原免疫性强,不加 佐剂就可获得很好的免疫效果。以细胞性抗原为例,免
疫时要求抗原量为
1


10
7
个细胞。初次免疫


10
7
/0.5ml
ip

2
~< br>3
周后,第二次免疫

10
7
/0.5ml ip

3
周后加强免疫(融合前三天)

10
7
/0.5ml ip

iv
,取脾融合。

2.3
细胞融合

2.3.1
细胞融合前准备




1
) 骨髓瘤细胞系的选择:
骨髓瘤细胞应和免疫动物属于同一品系,
高,
也便于接种杂交瘤 在同一品系小鼠腹腔内产生
样杂交融合率
宜,
ip

iv
月 左右根据确立免疫方案开始初次免疫,免疫方案应根据抗

McAb

骨髓瘤 细胞的培养可用一般
的培养液,

DMEM
培养基。
小牛血清的浓度 一般在
10%

20%

细胞浓度以
10
4


10
5
/ml
为宜,最大浓度不得超过
10
6
/ml
。当细胞处于对生长的中期时,可按
1

3
~< br>1

10
的比例传
代。每
3

5
天 传代一次。细胞在传代过程中,部分细胞可能有返祖现象,应定期用
8-
氮鸟
嘌呤进行 处理,使生存的细胞对
HA
T
呈均一的敏感性。



2
)饲养细胞
:在组织培养中,单个或少数分散的细胞不易生长繁殖,若加入其 它活
细胞,则可促进这些细胞生长繁殖,所加入的这种细胞数被称为饲养细胞。在制备
McAb
的过程中,
许多环节需要加饲养细胞,如在杂交瘤细胞筛选、
克隆化和扩大培养过程中 ,加
入饲养细胞是十分必要的。常用的饲养细胞有:小鼠腹腔巨噬细胞(较为常用)
、小鼠脾脏
细胞或胸腺细胞。饲养细胞的量为一般为

10
4

10
5
细胞
/
孔。

2.3.2
细胞融合的步骤





①将骨髓瘤细胞与脾细 胞按
1

10

1

5
的比例混合在一起 ,在
50ml
离心管中用无
血清不完全培养液洗
1
次,离心,
1200rpm

8min
;弃上清,用吸管吸净残留液体,以免影
响聚乙 二醇(
PEG
)浓度。轻轻弹击离心管底,使细胞沉淀略松动。




90s
内加入
37
℃预温的
1ml 45%PEG
(分子量
4000
)溶液,边加边轻微摇动。
37
℃水
浴作用90s

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