ELISA原理及步骤

2021年1月23日发(作者：金古良)
ELISA
原理

－－操作规则（新手适用）

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3347
发布时间：
2010-7-12 8:45:33
ELISA
原理

－－操作规则（新手适用）


酶联免疫吸附实验
ELISA






ELISA
法
是免疫诊断中的一项新技术，现已成功地应用于多种病原微生 物所引起的传
染病、
寄生虫病及非传染病等方面的免疫诊断。
也已应用于大分子抗原和 小分子抗原的定量
测定，根据已经使用的结果，认为
ELISA
法具有灵敏、特异、简 单、快速、稳定及易于自
动化操作等特点。
不仅适用于临床标本的检查，
而且由于一天 之内可以检查几百甚至上千份
标本
,
因此，也适合于血清流行病学调查。本法不仅可以 用来测定抗体，而且也可用于测定
体液中的循环抗原，所以也是一种早期诊断的良好方法。因此
ELISA
法在生物医学各领域
的应用范围日益扩大，可概括四个方面：

1
、免疫酶染色各种细胞内成份的定位。

2
、研究
抗酶抗体的合成。

3
、显现微量的免疫沉淀反应。

4
、定量检测体液中抗原或抗体成份。


一．实验目的


酶联免疫吸附测定（
enzyme-linked immunosorbent assay
简称
ELISA
）
是在免疫酶技 术（
immunoenzymatic
techniques
）的基础上发展起来的 一种新型
的免疫测定技术
,ELISA
过程包括抗原（抗体）吸附在固相载体上称为包 被，加
待测抗体（抗原）
,
再加相应酶标记抗体（抗原）
,
生成抗 原（抗体）－－待测
抗体（抗原）－－酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物。借助分光光度计的光吸收计算抗体（抗原）的量。待测抗体（抗原）的定量与有色
产生成正比。




二．实验原理


用于免疫 酶技术的酶有很多，
如过氧化物酶，
碱性磷酸酯酶，
β
－Ｄ－半乳
糖 苷酶，葡萄糖氧化酶，碳酸酐酶，乙酰胆碱酯酶，
6
－磷酸葡萄糖脱氧酶等。
常用于< br>ELISA
法的酶有辣根过氧化物酶，
碱性磷酸酯酶等，
其中尤以辣根过氧化< br>物酶为多。
由于酶摧化的是氧化还原反应，
在呈色后须立刻测定，
否则空气中的
氧化作用使颜色加深，无法准确地定量。



辣根过氧化 物酶（
HRP
）是一种糖蛋白，每个分子含有一个氯化血红素
（
proton hemin
）区作辅基。酶的浓度和纯度常以辅基的含量表示。氯化血红素
辅基的最大吸收峰是
403nm
，
HRP
酶蛋白的最大吸收峰是
275nm
，所 以酶的浓度
和纯度计算式是（已知
HRP
的
A
（
1cm 403nm 1%
）＝
25
，式中
1
％指
HRP
百 分浓
度为
100ml
含酶蛋白
1g
，即
10mg/ml，所以，酶浓度以
mg/ml
计算是
HRP
的
A
（
1cm
403nm
mg/ml=2.5
）
HRP
纯度
（
RZ
）
=A 403nm/A275nm
纯度
RZ
（
Ｒ
einheit
Zahl
）
值越大说明酶内所含杂质越少。
高纯度
HRP
的
RZ
值在
3.0
左右，
最高可达
3.4
。
用于ELISA
检测的
HRP
的
RZ
值要求在
3.0
以上。





ELISA
的
基本原理
有三条：


（
1
）抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，可能是蛋白和聚苯乙烯
表面 间的疏水性部分相互吸附，并保持其免疫学活性；


（
2
） 抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能
保持其免疫学和酶学活性；



（
3
）酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加 入底物的颜色反应来判定
是否有免疫反应的存在，
而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗 体的量成
正比例的，因此，可以按底物显色的程度显示试验结果。



三、实验方法





基本方法一

用于检测未知抗原的双抗体夹心法
:



1.

包被：用
0.05M PH9.
牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为
1
～
10
μ
g
／
ml
。在每个聚苯乙烯板的反应 孔中加
0.1ml
，
4
℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲
液 洗
3
次，每次
3
分钟。（简称洗涤，下同）。




2.

加样：
加一定稀释的待检样品
0.1ml
于上述已包被之反应孔中，
置
37
℃孵育
1
小时。
然后洗涤 。（同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔）。




3.

加酶标抗体：
于各反应孔中，
加入新鲜稀释的酶标抗体
（经滴定后的稀释度）
0.1ml
。
37
℃孵育
0.5
～
1
小时，洗涤。




4.

加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的
TMB
底物溶液
0.1ml
，< br>37
℃
10
～
30
分钟。




5.

终止反应：于各反应孔中加入
2M
硫酸
0.05ml
。




6.

结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察 结果：反应孔内颜色越深，阳性程度
越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“
+
”、
“
-
”号表示。也可测
O
·
D
值： 在
ELISA
检测仪上，于
450nm
（若以
ABTS
显色 ，则
410nm
）处，以空白对照孔调零
后测各孔
O
·
D< br>值，若大于规定的阴性对照
OD
值的
2.1
倍，即为阳性。




基本方法二

用于检测未知抗体的间接法：


用包被缓冲液将已知抗原稀释至
1
～
10
μ
g< br>／
ml
，

每孔加
0.1ml
，
4
℃过夜。次日洗涤
3
次。


↓


加一 定稀释的待检样品（未知抗体）
0.1ml
于上述已包被之反应孔中
,
置37
℃孵育
1
小时
,
洗
涤。（同时做空白、阴性及阳性 孔对照）


↓


于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二 抗体（抗抗体）
0.1ml
，
37
℃孵育
30-60
分钟， 洗涤
,
最后一遍用
DDW
洗涤。


↓


其余步骤同“双抗体夹心法”的
4
、
5
、
6。





（二）

酶与底物


酶结合物是酶与抗体或抗原
,
半抗原 在交联剂作用下联结的产物。
是
ELISA
成败的关键试剂，
它不仅具有抗体 抗原特异的免疫反应，
还具有酶促反应，
显示
出生物放大作用，但不同的酶选用不同的 底物。

免疫技术常用的酶及其底物



酶

邻苯二胺

四甲替联苯胺

氨基水杨酸

辣根过氧化物酶

邻联苯甲胺

2,2
＇
-
连胺基
-2
（
3-
乙基
-
蓝绿色

并噻唑啉磺酸
-6
）铵盐

642

底物

显色反应

橘红色

黄色

棕色

兰色

492*

460**

449

425

测定波长