Co-IP原理与方法

2021年1月23日发(作者：冉崇伟)


免疫沉淀（
Immunoprecipitation, IP
）原理

IP
是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“
protein A/ G
特异性地结合到抗体（免
疫球蛋白）的
FC
片段的现象开发出来的方法。目 前多用
protein A/G
预先结合在
argarose beads
上 ，使之
与含有抗原的溶液及抗体反应后，
beads
上的
prorein A /G
就能达到吸附抗原的目的。通过低速离心，可以
从含有目的抗原的溶液中将目的抗原与其它 抗原分离。


免疫沉淀实验的操作步骤比较多，同时由于在非变性条件下进行实验， 所以要得到一个完美的实验结
果，不仅需要高质量的抗体，同时对免疫沉淀体系也需要有严格的控制指标 。免疫沉淀实验从：蛋白样品处
理；抗体
-agarose beads
孵育；抗体
-agarose beads
复

基本实验步骤

(1
）收获细胞，加入适量细胞
IP
裂解缓 冲液（含蛋白酶抑制剂），冰上或者
4
℃裂解
30min
，

12,000g
离心
30 min
后取上清；

(2)
取少量裂解液以备
Western blot
分析，剩余裂解液将
1
μ
g
相应的抗体和
10-50
μ
l protein
A /G-beads
加入到细胞裂解液，
4
°
C
缓慢摇晃孵育过夜；< br>
(3
）免疫沉淀反应后，在
4
°
C
以
3,000 g
速度离心
5 min
，将
protein A/G-beads
离心至管底；将上
清小心吸去，
protein A/G-bea ds
用
1ml
裂解缓冲液洗
3
－
4
次；最后加入< br>15
μ
l
的
2
×
SDS
加样缓冲液，沸
水煮
10
分钟；

(4
）
SDS-PAGE, Western blotting
或进行质谱分析。

一、样品处理：

免疫沉淀实 验成功与否，第一步处理样品非常关键。免疫沉淀实验本质上是处于天然构象状态的抗原
和抗体之间的反 应，而样品处理的质量决定了抗原抗体反应中的抗原的质量，浓度以及抗原是否处于天然构
象状态。所以 制备高质量的样品以用于后续的抗体
-agarose beads
孵育对免疫沉淀实验是否成 功非常关
键。在这个环节中，除了要控制所有操作尽量在冰上或者
4
°完成外，最为关 键的是裂解液的成份。

用于免疫沉淀实验的样品一般是原代培养细胞裂解液或者细胞系裂解液 。我们以常用的
RIPA
裂解液为
例（主要含有
pH7.4
左右的离 子缓冲液，接近生理浓度下的
NaCl
，一定比例的去垢剂和甘油以及各类蛋白
酶抑制 剂等）来说明其各主要成份的用途，进而帮助我们如何针对不同的实验目的和不同的蛋白质特性来选
择最 佳的裂解液。

a
．缓冲液：离子缓冲液常采用
pH7.4
的
Hepes
或者
Tris-Cl
。

b
．
NaCl
浓度一般习惯用
150 mM
，这主要是因为
150 mM
接近生理浓度，不会破坏蛋白质之间的相互
作用。然而细胞内部的
NaCl
浓度并不是 均一的，局部
NaCl
的浓度可以低到
50 mM
，
150 mM
的
NaCl
有可能

会破坏这个区域的蛋白质相互作用。因此裂 解液配方最佳的
NaCl
浓度要视所分析的蛋白的亚细胞定位而
定。

c
．甘油由于其粘性，可以对蛋白质之间的相互作用起到一个很好的保护作用。一般添加
10 %
的甘油有
助于稳定蛋白质之间的相互作用。

d
．裂解液中的去垢 剂可以裂解细胞质膜，也同时破坏了许多细胞器的膜，从而释放了其中储存的许多
蛋白酶。而由于用于免 疫沉淀实验的去垢剂作用比较温和，因此蛋白酶的活性大部分得以保存。还有一部分
蛋白酶来自胞质中， 主要由于其抑制蛋白或者其活性抑制环境受到改变后从而恢复了蛋白酶活性。因此，添
加蛋白酶抑制剂对 于防止目的蛋白的降解从而完成免疫沉淀实验非常关键。一般主要通过添加
EDTA
抑制金属蛋白酶，通过
Protease Cocktail
（多种蛋白酶抑制剂混合物）可以抑制蛋白酶。

e
．去垢 剂对于免疫沉淀实验尤其是免疫共沉淀实验是一个非常关键的因素。不同的去垢剂种类和不同
的去垢剂浓 度主要通过影响以下三个因素来影响免疫沉淀效果：

-
细胞质
/
器膜的通透性：因为许多目的蛋白都定位在细胞器中，所以必须先将这些蛋白释放出来，抗
体才能与之反 应。

-
膜蛋白的释放：许多膜蛋白的构象对去垢剂种类和浓度非常敏感，因此针对 这类蛋白的免疫沉淀实
验，需要谨慎地尝试多种去垢剂以及不同浓度。

-
蛋白相互作用：不同去垢剂对不同性质的蛋白质的相互作用影响程度不一样，需要根据具体蛋白的
特性进 行分析选择去垢剂种类和浓度。而由于何种去垢剂适应作用于何种蛋白质现在很难精准预测，所以一
个更 为切实可行的办法就是通过具体实验筛选合适的去垢剂种类和浓度。

二、抗体
-agarose beads
孵育

裂解细胞，离心并去 除不可溶的膜组份后，上清可以储存在
-80
°保存
3
个月，但最好能够使用 新鲜制
备的细胞裂解液上清去进行抗体
-agarose beads
孵育实验。抗体 可以先加入上清中与样品孵育数小时后再
加入
Protein A
或者
G beads
孵育过夜，也可以同时加入抗体和
Protein A
或者
G b eads
孵育过夜。一般选
择
1mg
总蛋白（
1mg/ml
）对应添加
1 ug
抗体，最高可以添加至
5 ug
抗体，过多的抗体会产生 假阳性。这个
步骤中关键因素在于选择合适的阴性对照。一般选用加同样量的
IgG
， 但更为妥当的方法是选择针对胞内其
它无关目的蛋白的一抗做对照。例如，做膜蛋白
A
的免疫沉淀，选择膜蛋白
B
来做阴性对照，只要确认二者
之间没有相互作用；而做胞质 可溶性蛋白
C
的免疫沉淀，则选择另外一个可溶性蛋白
D
来做阴性对照。同< br>时，为避免
Protein A
或者
G beads
有（非）特异性吸 附从而造成免疫沉淀实验结果的假阳性，一般在加入
目的蛋白抗体之前，预先将
Protein A
或者
G beads
与细胞裂解液孵育数小时，然后取上清用于后续的抗体
-agarose beads
孵育。

同时，
Protein A
或者
G b eads
对不同类型的抗体亲和力不同，结合一抗的种属和
Ig
亚型，选择合适
的
Protein A
或者
G beads
也是决定免疫沉淀实验成功与否的一个重要因素。一般推荐使用
Protein A
和
Protein G beads
的混合物，这样可以达到最佳实验效果，而且省去了许多选择的烦恼。


三、抗体
-agarose beads
复合物洗涤：

除了选择特 异性好的抗体以及选择合适的阴性对照外，去除免疫沉淀实验非特异性的一个办法是对抗
体
-a garose beads
复合物进行多次洗涤。一般洗涤缓冲液使用和裂解液一样的配方，但去除甘油 ，以减少
由于甘油的粘性带来的非特异性吸附。针对不同的实验要求，还可以通过更改
NaCl
的浓度以及去垢剂的比
例，种类来达到去除非特异性吸附的效果。例如，针对单纯的免疫沉淀而 非免疫共沉淀实验或者虽然是进行
免疫共沉淀实验，但蛋白质之间的结合比较牢靠，可以考虑使用低浓度 （
0.2-0.5%
）的
SDS
洗涤抗体
-
agarose beads
复合物，这样可以去除绝大部分非特异性相互作用。

四、鉴定

免疫沉淀实验用途非常广泛（见
IP
：
Q&A
），而且基于最基本 的免疫沉淀实验衍生出了许多免疫沉淀
相关实验手段（比如免疫共沉淀，染色质免疫沉淀和
RN A-
蛋白免疫沉淀），因此，免疫沉淀实验的鉴定方
法主要视实验目的而定。

我们在本手册中主要简单概述常见的免疫沉淀之后的
WB
检测需要注意的实验环节。由于免疫 沉淀实验
使用目的蛋白抗体加
Protein A/G beads
与样品孵育，因此在最后离心获得抗体
-agarose beads
复合 物
后，
eppendorf
管中主要含有抗体，目的蛋白，
Protein A/G beads
以及一些其它非特异性作用蛋白。其
中，抗体和目的蛋白以及
Pr otein A/G beads
三者之间是以非共价健结合在一起，只有
Protein A/G
与
agarose beads
是共价结合在一起的。因此，最后经过添加含巯 基乙醇的加样缓冲液以及煮沸变性并离心出
去
Protein A/G beads
后 ，
eppendorf
管只有抗体和目的蛋白以及少量非特异性吸附蛋白。这样
SDS -PAGE
中就含有目的蛋白和抗体二种蛋白，由于加样缓冲液中含有巯基乙醇从而导致抗体的重链与轻 链之间的二硫
键被破坏从而使得抗体分子变成重链分子（
55KD
）和轻链分子（25KD
）。因此，
WB
显色反应中除了能检测
到目的蛋白外，如果所使 用的二抗与用于免疫沉淀实验的抗体分子属于同一种属的话，还能检测到重链和轻
链分子。通常用于免疫 沉淀的抗体量非常大（
1ug
），所以当目的蛋白的大小接近重链或者轻链分子时，重
链或者轻链分子的
WB
信号常常由于信号过强而导致影响对目的蛋白的
WB
结 果判断。

针对上述情况，通常有二种解决办法：

a
．选择不同种 属的抗体分别进行免疫沉淀实验和
WB
实验，这样再选择一个种属交叉反应比较弱或者
无种属交叉反应的二抗进行
WB
实验，就可以大大减弱重链和轻链分子的
WB
信号。

b
．使用交联剂将抗体和
Protein A/G beads交联，然后通过添加不含巯基乙醇的加样缓冲液处理目的
蛋白
-
抗体
-a garose beads
复合物，最后离心去除抗体
-agarose beads
复合物，上清中只留下目的蛋白。

免疫沉淀，免疫共沉淀（
Co- immunoprecipitation
，
CO- IP
）和染色质免疫沉淀（
Chromation
immunoprecipitation
，
CH


免疫共沉淀（
Co-Immunoprecipitation
）是以抗体和抗原之间 的专一性作用为基础的用于研究
蛋白质相互作用的经典方法，是确定两种蛋白质是否在生理条件下有相互 作用的有效方法。其原理

是：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质 －蛋白质间的相互作用被保留
了下来。如果用蛋白质
X
的抗体免疫沉淀
X，那么与
X
在体内结合的蛋白质
Y
也能沉淀下来。这种
方法常用 于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用蛋白。

染色质免疫沉淀（
Chromatin immunoprecitation
，ChIP
）是研究体内
DNA
与蛋白质相互作用
的重要工具。它的基本原 理是在生理状态下把细胞内的蛋白质和
DNA
交联在一起，超声波将其打碎
为一定长度 范围内的染色质小片段，然后通过所要研究的目的蛋白质特异性抗体沉淀此复合物，特
异性地富集目的蛋 白结合的
DNA
片段，通过对目的片断进行
PCR
检测，可以知道目的蛋白与 那些基
因作用。

RNA
免疫沉淀是研究体内
RNA
与蛋白 质相互作用的重要手段。它的基本原理是在生理状态下针
对可以结合
RNA
的蛋白质进 行免疫沉淀，然后通过分离抗体
-Protein A/G beads
复合物中的
R NA
成
份，最后通过基因芯片或者其它手段检测目的
RNA
。

由此可见，
CO-IP
和
CHIP
以及
RIP
都是 基于
IP
的基本原理去实现不同的研究目的，
CO-IP
主
要是研究 目的蛋白
X
和与之发生相互作用的蛋白
Y
之间的作用关系；而
CHI P
主要是研究目的蛋白
X
和与之发生相互作用的
DNA
片段
Y
之间的作用关系；
RIP
主要是研究
RNA
结合蛋白和
R NA
之间的结
合。这也就决定了在进行
IP
，
CO-IP
和
CHIP
以及
RIP
实验时时操作步骤和涉及的缓冲液配方都有所
不 同。

免疫沉淀，免疫共沉淀，染色质免疫沉淀和
RNA
免疫沉淀在实验操作 中所要注意的关键点的主要区别是什
么？


免疫沉淀：因为免疫沉淀的目的 主要是通过抗体和目的蛋白相互作用从而捕获目的蛋白，所以
实验中要注意的关键点是抗体和目的蛋白相 互作用的效果。其主要受抗体的结合能力，目的蛋白和
抗体的可接触性两个因素影响。所以免疫沉淀实验 中的关键因素是抗体的选择以及裂解缓冲液中的
配方。对于前者而言，抗体所针对的作用表位必须处于目 的蛋白表面，对抗体结合力的要求和免疫
印迹或者免疫荧光相比要高得多；对于后者而言，主要考虑因素 是缓冲液中的去垢剂成分能否在不
破坏目的蛋白天然构象的情况下（不影响目的蛋白和抗体的相互作用效 果）将目的蛋白从细胞局部
定位（比如位于某些细胞器中）中有效释放出来。

免疫共 沉淀：免疫共沉淀的目的是通过抗体和目的蛋白的相互作用从而捕获目的蛋白复合物，
最终检测目的蛋白 复合物中各成分之间的相互作用。所以实验中要注意的关键点和免疫沉淀相比，
除了要注意抗体和目的蛋 白相互作用的效果外，还要注意目的蛋白复合物的完整性。后者主要考虑
因素是缓冲液中的去垢剂成分能 否在有效释放目的蛋白复合物进入可溶相的情况下不破坏目的蛋白
复合物中各成分之间的相互作用。所以 ，免疫共沉淀实验中的关键因素除了抗体的选择外，裂解缓
冲液配方中的去垢剂的成分和浓度对免疫共沉 淀实验的成功与否至关重要，其选择相比免疫沉淀实
验而言，要求更严格。

染色质免 疫共沉淀：染色质免疫沉淀的主要目的通过抗体和目的蛋白的相互作用从而捕获和目
的蛋白有相互作用的
DNA
片段，最终检测目的蛋白和
DNA
片段的相互作用。因此，实验中要注 意的