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ELISA_直接法与间接法的区别

作者:陕西保健网
来源:http://www.xapfxb.com/yuer
更新日期:2021-01-23 18:34

新西兰惠氏奶粉-

2021年1月23日发(作者:闻人益)


ELISA
可用于测定抗原
,
也可用于测定抗体
.
在这种测定方法中有三个必要的试剂
1)
固相的抗
菌素原或抗体
,


免疫吸附剂

酶标记的抗原或抗体
,
称为

结合物

酶反应的底物
.
根据试剂的来源和标本的情况以及检测的具 体条件
,
可设计出
各种不类型的检测方法
.
ELISA
可分类是根据抗原抗体的结合情况来分类的。

主要有以下几种类型
:
(直接法也称一步法)

1
双抗体夹心法测抗原

双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法
,
操作步骤如下
:
1) < br>将特异性抗体与固相载体联结
,
形成固相抗体
.
洗涤除去未结合的抗体 及杂质
.
2)
加受检标本
,
保温反应
.
标本中 的抗原与固相抗体结合
,
形成固相抗原抗体复合物
.
洗涤除去
其他未 结合物质
.
3)
加酶标抗体
,
保温反应
.
固相 免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合
.
彻底洗涤未结合的酶标
抗体
.
此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关
.
4)
加底物显色
.
固相上的酶催化底物成为有色产物
.
通过比色
,
测知标本中抗原的 量
.
在临床检
验中
,
此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原
,
例如
HBsAg,HBeAg,AFP
,hCG

.
只 要获得针对
受检抗原的异性抗体
,
就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法< br>.
如抗体的来源为抗
血清
,
包被和酶标用的抗体最好分别取自不同种属 的动物
.
如应用单克隆抗体
,
一般选择两个
针对抗原上不同决定簇的 单抗
,
分别用于包被固相载体和制备酶结合物
.
这种双位点夹心法具
有很高的特异性
,
而且可以将受检标本和酶标抗体一起保温反应
,
作一步检测
.
在一步法测定中
,
当标本中受检抗原的含量很高时
,
过 量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合
,
而不再形成

夹心复合物
类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象
,
此时反应后显色的吸光值
(
位于 抗原过剩带上
)
与标准曲线
(
位于抗体过剩带上
)
某一抗原 浓度的吸光值相同
(
参见
1.3.2,

1-4),
如按常 法测读
,
所得结果将低于实际的含量
,
这种现象被称为钩状效应
(h ook
effect),

为标准曲线到达高峰后呈钩状弯落
.
钩 状效应严重时
,
反应甚至可不显色而出现假阴性结果
.
因此在使用一步法试剂 测定标本中含量可异常增高的物质
(
例如血清中
HBsAg,AFP
和尿液< br>hCG

)

,
应注意可测范围的最高值
.
用高亲和力的单克隆抗体制备此类试剂可削弱钩状效

.
假使在被测分子的不同位点 上含有多个相同的决定簇
,
例如
HBsAg

a
决定簇,
也可用针对此
决定的同一单抗分别包被固相和制备酶结合物
.
但在HBsAg
的检测中应注意亚型问题
,HBsAg

adr,adw,a yr,ayw4
个亚型
,
虽然每种亚型均有相同的
a
决定簇的反应性
,
这也是用单抗作夹心
法应注意的问题
.
双抗体夹心法测抗原的另 一注意点是类风湿因子
(RF)
的干扰
.RF
是一种自身抗体
,多为
IgM

,
能和多种动物
IgG

Fc< br>段结合
.
用作双抗体夹心法检测的血清标本中如含有
RF,
它可充当抗 原
成份
,
同时与固相抗体和酶标抗体结合
,
表现出假阳性反应
.
采用
F(ab')

Fab
片段作酶结合物
的试剂,
由于去除了
Fc

,
从而消除
RF
的干扰< br>.
双抗体夹心法
ELISA
试剂是否受
RF
的影响
,

被列为这类试剂的一项考核指标。

双抗体夹心法适用于测定二价或二价以 上的大分子抗原
,
但不适用于测定半抗原及小分子单
价抗原
,
因其不 能形成两位点夹心
.
2
双抗原夹心法测抗体

反应模式与双抗体 夹心法类似
.
用特异性抗原进行包被和制备酶结合物
,
以检测相应的抗体.
与间接法测抗体的不同之处为以酶标抗原代替酶标抗抗体
.
此法中受检标本不需 稀释
,
可直接
用于测定
,
因此其敏感度相对高于间接法
.< br>乙肝标志物中抗
HBs
的检测常采用本法
.
本法关键
在于酶标 抗原的制备
,
应根据抗原结构的不同
,
寻找合适的标记方法
.
3
间接法测抗体

间接法是检测抗体常用的方法
.
其原理 为利用酶标记的抗抗体
(
抗人免疫球蛋白抗体
)
以检测
与固相抗原结 合的受检抗体
,
故称为间接法
(
见图
2-3).
操作步骤如 下
:
1)
将特异性抗原与固相载体联结
,
形成固相抗原
.
洗涤除去未结合的抗原及杂质
.2)
加稀释的受
检血清
,
保 温反应
.
血清中的特异抗体与固相抗原结合
,
形成固相抗原抗体复合物
.
经洗涤后
,

相载体上只留下特异性抗体
,
血清中的其 他成份在洗涤过程中被洗去
.
3)
加酶标抗抗体
.
可用酶标抗人< br>Ig
以检测总抗体
,
但一般多用酶标抗人
IgG
检测
IgG
抗体
.
固相
免疫复合物中的抗体与酶标抗体抗体结合
,
从而间接地标记上酶
.
洗涤后
,
固相载体上的酶量
与标本中受检抗 体的量正相关
.
4)
加底物显色本法主要用于对病原体抗体的检测而进行传染病的诊 断
.
间接法的优点是只要
变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方 法
.
间接法成功的关键在于抗
原的纯度
.
虽然有时用粗提抗原包被也 能取得实际有效的结果
,
但应尽可能予以纯化
,
以提高
试验的特异性
.
特别应注意除去能与一般健康人血清发生反应的杂质
,
例如以
为工程酶
的重组抗原
,
如其中含有

成份
,
很可 能与受过

感染者血甭中的抗

抗体发生反

.
抗原中 也不能含有与酶标抗人
Ig
反应的物质
,
例如来自人血浆或人体组织的抗原< br>,
如不将
其中的
Ig
去除
,
试验中也发生假阳性反应
.
另外如抗原中含有无关蛋白
,
也会因竟争吸附而影
响包被效果.
间接法中另一种干扰因素为正常血清中所含的高浓度的非特异性
.
病人血清中 受检的特异性
IgG
只占总
IgG
中的一小部分
.IgG
的 吸附性很强
,
非特异
IgG
可直接吸附到固相载体上
,
有时 也
可吸附到包被抗原的表面
.
因此在间接法中
,
抗原包被后一般用无 关蛋白质
(
例如牛血清蛋白
)
再包被一次
,
以封闭
(blocking)
固相上的空余间隙
.
另外
,
在检测过程中标本 须先行稀释
(1:40~1:200),
以避免过高的阴性本底影响结果的判断
.
酶标抗体制备技术

百科名片

酶标抗体制备技术基本要求是将酶分 子与抗体或抗抗体分子共价结合,
此种结合既不改变抗
体的免疫反应活性,
也不影响酶 的生物化学活性。
用于标记抗体的酶较多,
常用的有辣根过
氧化物酶、碱性磷酸酶、葡 萄糖氧化物酶和
β
-
半乳糖苷酶等。

目录

辣根过氧化物酶标抗体制备技术

过氧化物酶

McAb- PAP
制备技术

碱性磷酸酶标抗体制备技术

碱性磷酸酶

展开

辣根过氧化物酶标抗体制备技术

过氧化物酶

McAb-PAP
制备技术

碱性磷酸酶标抗体制备技术

碱性磷酸酶

展开

编辑本段辣根过氧化物酶标抗体制备技术

辣根过氧化物酶(
horseradish
peroxidase

HRP
)广泛分布于植物中,因辣根中含量最高而
得名,由无色酶蛋白和深棕色铁卟啉(辅基 )构成一种糖蛋白(含糖
18%

。此酶溶于水和

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