高、低密度脂蛋白胆固醇的匀相测定

2021年1月22日发(作者：崔宪祥)
高、低密度脂蛋白胆固醇的匀相测定法及技术要求


『

摘

要

』
：

近些年来，
国内 外相继研制开发出一些新型高、
低密度脂蛋白胆固醇
（
HDL-C/LDL-C
）
HDL-C
、
LDL-C
的直接匀相测定法
（
homo geneous
methods
）
试剂。
如测定
HDL-C
用的选择性抑制法
（
PPD
法），
PEG
修饰酶法（
PE GME
法），清除法（
Clearance
method
）包括反应促进剂
-
过氧化物酶清除法
（
SPD
法）和过氧化氢酶清除法（
C AT
法），免疫分离法（
IS
法）包括
PEG/
抗体包裹法（
IRC
法）和抗
体免疫分离法（
AB
法）；测定
LDL-C
用的表面活性剂清除法（
SUR
法），过氧化氢酶清除法（
CAT
法），< br>杯芳烃法（
CAL
法），可溶性反应法（
SOL
法）和保护性试剂法（
PRO
法）。这些方法因其简便、快速，
易于自动化，已引起关注并广泛应用于临床常 规分析。本文对
HDL-C
、
LDL-C
的测定方法进行了回顾，
并 重点介绍了各种匀相测定法的检测原理，以及临床测定时的技术要求。

『

关键词

』：

高密度脂蛋白胆固醇

低密度脂蛋白胆固醇

匀相测定法



众多流行病学与临床研究证实，动脉粥样硬化、冠心病的发生率与血清高密度脂蛋白胆固醇
(HDL-C )
水平呈负相关，而与低密度脂蛋白胆固醇
(LDL-C)
水平呈正相关。近年来国内 外相继研制开
发出一些新型
HDL-C
、
LDL-C
的直接测定方法 即匀相测定法
(homogeneous methods)
试剂，因其简便、
快速， 易于自动化，已引起关注并广泛应用于临床常规分析。




1 HDL-C
检测方法



1.1
概述

测定血清
HDL-C
通常需根据各种脂蛋白的密度、颗粒大小、电荷等应用超速离心法、色谱法、电泳法、化学或免疫沉淀法将
HDL
与其他脂蛋白分离开，测定
HDL< br>组分中胆固醇含量。美国
疾病控制与预防中心
(CDC)
测定
HDL- C
的参考方法为超速离心法，
也为
NCEP
所推荐。
CDC
胆固醇参考方
法实验室网络
(CRMLN)
近来选用了一种
“
指定的 比较方法
”
(DCM
法
)
作为转移
CDC
参考方法 准确性的适
用方法
—
硫酸葡聚糖
-
镁
(DS50-Mg2+ )
沉淀结合
ALBK
法。色谱法和电泳法因仪器、操作要求高等种种
原因临床 常规实验室也较少应用，多用于脂蛋白的研究。




国外把临床 常规实验室直接分离测定
HDL-C
的方法分为
3
代。
第
1
代为化学沉淀法，
常用的沉淀剂
为多阴离子，
如磷钨酸
(PTA)< br>、
DS
、
肝素或非离子多聚体如聚乙二醇与某些二价阳离子
(
如
Mg2+
、
Ca2+
、
Mn2+)
合用。最早为美国国立 卫生研究院
(NIH)
所采用的肝素
-
锰沉淀法，后多采用
DS50 -Mg2+
法，欧
洲则多采用磷钨酸镁沉淀法
(PTA-Mg2+
法
)
和聚乙二醇沉淀法
(PEG
法
)
。
但此类方法受高甘油三 酯
(TG)
的影响。第
2
代采用简便的磁珠
DS- Mg2+
分离法
(
美国
Reference Diagnostics
和
Polymedco
公司试
剂
)
，省去了离心步骤，但需特殊装置，试剂不适于推广应用。第
3
代为匀相测定法，标本用量少 ，
不需沉淀处理，可用于自动生化分析仪测定，在准确度和精密度方面基本达到
NCEP 的分析目标，因
此在短短的数年里迅速被临床实验室采用。国内情况与国外有些不同，也可分为3
代。第
1
代为电泳
法；第
2
代为化学沉淀法，
1995
年中华医学会检验分会曾在国内推荐
PTA-Mg2+
法作为
HD L-C
测定常规
方法；第
3
代为目前广泛使用的匀相测定法。




1.2
匀相测定法



1.2.1
选择性抑制法
(polyanion polymer/ detergent HDL-C assay
，
PPD
法
)
亦称 选择性遮蔽
法。其应用两种不同的表面活性剂及多聚阴离子，根据脂蛋白的酶反应选择性，直接测定HDL-C
。该
方法的主要代表试剂盒为日本第一化学
(Daiichi pure chemicals Co.)Cholestest HDL
和美国
Genzyme Diagnostics
公司的
N-geno usTMHDL-C
试剂盒。主要反应式如下：







1.2.2 PEG
修饰酶法
(PEG-modified enzyme HDL-C assay
，
PEGME
法
)
在Mg2+
的存在下，
α
-
环糊
精硫酸盐与
CM
、
VLDL
、
LDL
形成可溶性复合物。这些复合物能抵抗变构酶

的作用；
PEG6000
或葡聚糖
右旋糖苷与
CHER
和< br>CHOD
共价结合，引起酶的变构，变构酶对脂蛋白的大小和
/
或电荷具有选择 性，其
顺序依次为
LDL
＜
VLDL
≈
CM
＜HDL
。而
a-
环糊精硫酸盐能限制
CM
、
VLDL< br>颗粒进入环状的环糊状结构，
从而避免酶的催化作用，这种作用还与
Mg2+
浓 度有关。因此在
Mg2+
及少量
DS
存在的前提下，可直接
测定< br>HDL-C
。主要代表性试剂盒有日本协和
(Kyowa Medex Co.)
、罗氏诊断
(Roche Diagnostics)
和德
国
Centronic GmbH
公司的产品。主要反应式如下：







1.2.3
清除法
(clearance method)


1.2.3.1
反应促进剂
-
过氧化物酶清除法
(synthetic polymer/detergent HDL-C assay , SPD
法
)


其原理为利用脂蛋白与表面活性剂的亲和性差异。加入试剂Ⅰ，在反应促进剂(
合成的多聚物
/
表面活性剂
)
的作用下，血清中
CM
、
VLDL
及
LDL
形成可溶性复合物，它们表层的游离胆固醇在< br>CHOD
的
催化下发生反应生成
H2O2
，在过氧化物酶
(P OD)
的作用下，
H2O2
被清除。加入试剂Ⅱ，在一种特殊的
选择性表面活 性剂作用下，只有
HDL
颗粒是可溶的，所释放的胆固醇与
CHER
和
CHOD
反应，生成
H2O2
，
并作用于
4-AAP
色原 体产生颜色反应。代表试剂盒是日本第一化学新近推出的
Cholestest
N
HDL
试剂
盒。主要反应式如下：







1.2.3.2
过氧化氢酶清除法
(catalase
HDL-C
assay
，
CAT
法
)
其原理为试剂Ⅰ中具有特异选择
性的强离子缓冲液与表面活性剂作用于血清中
CM
、
VLDL
及LDL,
使其所含的胆固醇暴露，在
CHER
和
CHOD
的催 化反应下生成
H2O2
，
H2O2
被过氧化氢酶
(catalase )
分解为
H2O
和
O2
而被清除。试剂Ⅱ中的
叠氮钠抑制 了过氧化氢酶活性，
另一表面活性剂使
HDL
颗粒中的胆固醇暴露，
并与胆固 醇酶试剂发生
反应，用标准的
Trinder
反应即可测定
HDL-C
。应用两点速率法可减少高胆红素和高
TG
对测定结果的
影响。代表试剂盒是日本生 研
(Denka Seiken Co.)
和英国朗道
(Randox Laboratories Limited)
公司
试剂盒。主要反应式如下：







1.2.4
免疫分离法
(immunoseparation method, IS
法
)


1.2.4.1 PEG/
抗体包裹法
(International Reagents Corp HDL-C assay
，
IRC
法
)
为最早期由
日本国际试药公司
(International
Reagents
Co.)
研制的试剂盒
(
测定过程包括
4
种试剂
)
。原理是先
用低浓度的
PEG4000
包裹CM
、
VLDL
、
LDL
，加入特异性抗
apoB、
apoCIII
抗体，使
CM
、
VLDL
和
LDL
颗粒
复合物凝聚，然后加入胆固醇酶试剂，用于检测上述复合物以外脂蛋白胆固醇
(
即
HDL-C)
，最后加入
盐酸胍试剂，终止酶促反应和溶解含
apoB
脂蛋白复合物，以免其干扰吸光度测定。主要反应式如下：







1.2.4.2
抗体免疫分离法
(antibody immunoseparation HDL-C assay
，
AB
法
)
由日本和光制药
公司
(Wako Pure Chemicals Industry )
新推出的试剂。其原理与上述方法相似。试剂Ⅰ中的抗人
β
脂蛋白抗体首先与血清中 的
CM
、
VLDL
、
LDL
结合形成不溶性抗原
-
抗体复合物；加入试剂Ⅱ后，抗原
-
抗体复合物不与酶试剂起反应，只有
HD L-C
与酶试剂反应，生成
H2O2
，并通过
Trinder
指示反 应测定
HDL-C
含量。主要反应式如下：







2 LDL-C
的测定方法



2.1
概述

测定血清
LDL-C
通常需根据各种脂蛋 白密度、颗粒大小、电荷或
apoB
含量等，应用超
速离心法、色谱法、电泳法、化学 或免疫沉淀法将
LDL
与其他脂蛋白分离开，然后测定
LDL
组分中胆
固醇含量。
目前尚没有真正意义的测定
LDL-C
的参考方法。
CDC测定
LDL-C
暂定的参考方法为超速离心
法
(
β
-< br>定量法
/BQ
法
)
，也为
NCEP
所推荐。此法测定 的
LDL-C
，实际上包括脂蛋白
(a)[Lp(a)]
和中间密
度 脂蛋白
(IDL)
的胆固醇含量，
也是评价其他检测方法准确性的基础。
此法 需昂贵的设备、
操作复杂、
费时且技术要求高，不易在普通实验室开展。
Friede wald
公式计算法是目前应用较广的估测
LDL-C
的方法，被
NCEP< br>推荐为常规测定方法。其以
VLDL
组成恒定
(VLDL-C/TG
=0.2
，均以
mg/dl
计
)
的假设为
前提，具有简便、 直接、快速等优点。应用此公式计算
LDL-C
常受
TC
、
TG和
HDL-C
变异的影响，总变
异可达
9.5%
。但在血清中存 在
CM
、血清
TG
＞
4.52mmol/L
(400mg /dl)
、血清中存在异常
β
脂蛋白时
[
Ⅲ
型高脂血症(HLP)]
时不宜采用
Friedewald
公式法计算。色谱法和电泳法因仪 器、操作要求高等种种
原因临床常规实验室也较少应用，多用于脂蛋白的研究。