高通量测序技术在无创产前检测中的应用

2021年1月22日发(作者：黄婉伶)
高通量测序技术在无创产前检测中的应用

摘要：
随着以高通量、
自 动化为显著特征的二代测序技术的发展，
基于该技术的无创产前检测
(NIPT)
在临 床上迅速得以应用。
国际上发
表了一系列与
NIPT
相关的指导意见，
我国卫计委也于今年发布了技
术规范。文章将对
NIPT
技术规范进行解读，并对高 通量测序技术在
NIPT
应用中的优势、局限性和临床应用要点进行评价。

染色体非整倍体是胎儿出生缺陷最常见病因之一，
其中以
21-
三
体综合征、
18-
三体综合征最为常见，
占所有足月妊娠的
0.2%~0.3%
。
对先天性遗传病进行产前筛查和产前诊断是优生优育的重要保证。
自
1970
年以来，针对上述胎儿染色体疾病的产前筛查和产前诊断已逐
渐应用到临床上，并在降低出生缺陷方面 得到了良好的效果。

从取材方法进行分类，
产前检查分为有创性和无创性两种。有创
性产前诊断是目前诊断胎儿染色体疾病的的金标准，
主要是指通过绒
毛活检术 、
羊水穿刺术和脐静脉穿刺术采集胎儿细胞或组织，
进行细
胞核型分析获取胎儿染色体 信息，有创检测的准确率为
98%~99%
，
但伴有
0.5%~1.0%的流产风险，同时也会伴有羊水渗漏、宫内感染
等风险。因此，
有创产前诊断目前仅应用于 筛查高风险、高龄妊娠或
家庭中生育过遗传病患儿等情况。
传统的无创性产前检查主要有超声< br>检查和孕妇血清学检测等方法，
使用这些方法进行检测可避免对胎儿
和孕妇造成的危害， 但是其灵敏度及特异性有限。近
20
年来，基于
超声检查和孕妇各种蛋白或激素的血清 学筛查相结合的产前筛查发
展迅速。
产前母体血清学筛查的目标疾病是
21
、
18-
三体综合征和神
经管缺陷，当假阳性率控制在
5%
时，在早孕 期、中孕期、早中孕期
的检出率分别为
82%~87%
、
81%
、< br>94%~96%[1]
，这些方法的假
阳性率较高，
为后续有创性产前诊断带来 较大的临床压力与实验室压
力。

常规产前筛查和有创性产前诊断方法的局限性促使研 究者积极
开发一种针对胎儿染色体非整倍体及其他染色体异常的、
无创伤性的
高精度检 测方法。
1997
年
Lo
等
[2]
通过孕育男性胎儿的孕妇 外周血
血浆
Y
染色体
PCR
扩增的方法证明了孕妇外周血循环中存在 胎儿游
离
DNA(cell free fetal DNA
，
cffDNA )
，开启了基于
cffDNA
无创
产前检测
(non- invasive prenatal testing
，
NIPT)
方法。其后，利 用
各种分子诊断技术对
cffDNA
的检测已经在胎儿性别鉴定、
Rh
血型
鉴定、
X
连锁隐性遗传病、先天性多囊肾检测等方面得到应用，但由
于 方法繁琐、耗费时间长、精度低、费用较高等问题，一直难以推广
于临床。

近年来，
随着以高通量、
自动化为显著特征的二代测序技术的发
展，基于该技术的
NI PT
在临床上迅速得以应用。今年，国家卫生计
生委妇幼司发布了第一批高通量测序技术临床应 用试点单位，
同时发
布了《高通量基因测序产前筛查与诊断技术规范
(
试行< br>)
》
。如何充分
理解并合理规范应用
NIPT
，如何正确解读 技术规范，将
NIPT
作为
常规产前筛查方法时有哪些注意事项，
我国产前筛 查和产前诊断体系
中
NIPT
该如何正确定位等，本文将对这些问题进行深入探讨。< br>
一、母血中胎儿游离
DNA
的特性

大量研究发现，
cffDNA
来源于凋亡的胎儿滋养层细胞，经过胎
盘屏障时受母体免疫攻击破裂或胎盘细胞 凋亡进入母血，
自然降解成
DNA
片段。绝大部分的
cffDNA
都 是包裹在核小体外部，与胎儿游
离
RNA(cell free fetal RNA
，
cffRNA)
相比，
其在外周血浆中的性质
更加稳定。早期研究认为，< br>cffDNA
在早、晚孕期分别占孕妇外周血
总
DNA
的
3%
、
6%
，不同孕妇间个体差异性较大，其中
80%
的片
段长 度
<193bp
，最早可从孕
4
周时检出，且在
7
周时稳定 存在，随
孕周延长而增加
[3]
。最近研究发现，
cffDNA
在早 、中、晚孕期时含
量分别为
9.7%
、
9.0%
、
20%< br>，分娩后母体
cffDNA
快速降解，
2h
内快速消失，
半衰 期为
16.3min
，
再次妊娠
cffDNA
的检测不受上次
妊娠影响
[4]
。

孕妇外周血中
cffDNA
微量存在 、
非整倍体检测过度依赖于特定
基因位点等特点，
严重限制了使用常规分子生物学方法 检测胎儿染色
体非整倍体的技术可靠性和使用范围，迫切需要一种快速、高精度、
可自动化的方 法。
新一代高通量测序方法的出现，
可轻易实现同时针
对百万以上单分子多拷贝
PCR
克隆阵列的检测，
该方法对游离
DNA
的研究已经成功应用到无创产 前检测、
癌症和器官移植标志物研究等
方面。

二、基于高通量测序技术的
NIPT
2008
年
Lo
和< br>Quake
两个小组开创性地使用第二代高通量测序
技术，
对孕妇外周血浆进行 测序，
成功检测出
21-
三体综合征
(trisomy
21,T2 1)
胎儿
[5-6]
，后续研究表明该方法的敏感性仅受限于测序序列
的数据 量，
其分析的原理是胎儿为
T21
时，
胎儿的
21
号染色体
2
个
拷贝数变成了
3
个拷贝数，从孕妇外周血游离
DNA< br>中检出的
21
号
染色体来源的序列
(
包括
T21胎儿和正常孕妇
)
占整个基因组的比例较
胎儿为
21
号染色体< br>2
个拷贝数时升高。

大量的科研小组对该方法的临床应用进行了验证，
并使得该方法
逐渐成为新的无创检测染色体非整倍体的方法。
Chiu
等
[ 7]
研究
753
例筛查高风险孕妇，其中
86
例
T21胎儿，结果表明，该方法针对
T21
胎儿有
100%
的检测灵敏度和97.9%
的特异度，紧接着
Ehrich
和
Sehnert
两 个小组通过类似的方法证明了该方法的高灵敏度和特
异度
[8]
。
Bianc hi
等
[9]
对
532
个样本进行了分析，与其他研究不同
的是，
此研究对包括易位型三体、
嵌合体及复杂变异在内的胎儿非整
倍体进行检测，发 现
13
、
18
、
21
、
X
、
Y< br>五大染色体非整倍体的检
测灵敏度为
78.6%~100%
，
特异度为
99.8%~100%
，
并发现某个染
色体为非整倍体时并不影响其他染色体 整倍体状态的分析。

针对
18-
三体综合征
(trisomy < br>18
，
T18)
和
13-
三体综合征
(trisom y 13
，
T13)
的检测，
Chen
等
[10]
研究小组使用改进后的算法
分析发现
T13
、
T18
的灵敏度提高到
98.9%
和
91.9%[10]
。
Palomaki
等< br>[11]
后续研究亦使用类似方法，对
T18
和
T13
的检出 率分别为
100.0%
和
91.7%
，
假阳性率分别为
0. 28%
和
0.97%
；
对
283
个染色
体非整倍体 异常样本复合检出率为
98.9%
，总的假阳性率仅
0.5%
。
< br>近期，
北京协和医院完成的一项以低危为主的孕妇人群进行游离
胎儿
DNA检测的研究，有效样本
1741
例，准确检出其中的
15
例