乙肝两对半操作规程

2021年1月22日发(作者：左漠野)

















免疫室乙肝两对半操作规程

一、试验原理

“乙肝两对半”
指乙型肝炎病毒表面抗原（
HBSAg
）
、乙型肝炎病
毒表面抗体（
HBSAb
）
、乙型肝炎病毒
e
抗原（
HBeAg
）、乙型肝炎病毒
e
抗体（
HBeAb
）
、乙型肝炎病毒核心抗体 （
HBcAb
）此五项指标，目
前国内医院最常用的乙肝病毒感染检测血清标志物，< br>判断是否感染乙
肝与粗估病毒复制水平初步检查。两对半中各项试验反应原理如下：

1
、


乙型肝炎病毒表面抗原检测：


采用
ELISA
“双抗体夹心法”原理，用抗
-HBs
包被板条，用
HRP
标记抗
-HBs
为

酶标记物，以四甲基联苯氨（< br>TMB
）和过氧化物为底
物。当标本中存在
HBSAg
时，该表面抗原 与包被抗
-HBs
结合并与抗
-HBs- HRP
结合形成抗
-HBs-HBSAg-
抗
-HBs-HRP
复合 物，
加入
TMB
底物
产生显色反应，反之则无显色反应。在试验结束时，有颜 色变化的，
提示有
HBSAg
存在，
无颜色或颜色变化微弱的，
则提 示不存在
HBSAg
。

2
、


乙型肝炎病毒表面抗体检测：


采用
ELISA
“ 双抗原夹心法”检测人血清或血浆中的抗
-HBS,
采
用
HBSAg
包被反应板，
加入待测标本，
同时加入
HBSAg-HRP
进行孵育。
当标本中存在抗
-HBS
时，该抗体与包被的
HBSAg
结合并与酶结合物
形成
HBSAg-
抗
-HBS-HBSAg-HRP
复合物，洗去游 离反应物，加入显色
剂，将有明显颜色变化；当标本中没有抗
-HBS
时，加入底物后 没有
或只有很轻微的颜色变化。

3
、


乙型肝炎病毒
e
抗原检测：


采用
ELI SA
“双抗体夹心法”检测，用单抗
-HBe
包被板条，用
HRP
标 记抗
-HBe
为酶标记物，以四甲基联苯氨（
TMB
）和过氧化物为
底物。当标本中存在
HBeAg
时，该
HBeAg
与包被抗
-HBe
结合并与抗
-HBe-HRP
结合形成抗
-HBe- HBeAg-
抗
-HBe-HRP
复合物，
加入
TMB
底物
产生显色反应，反之则无显色反应。在试验结束时，有颜色变化的，
提示有
HBeAg
存在，
无颜色或颜色变化微弱的，
则提示不存在
HBeAg
。

4
、


乙型肝炎病毒
e
抗体检测：


采用
LEI SA
“中和竞争法”检测抗
-HBe
，用单抗
-HBe
包被板条，< br>用
HRP
标记的多抗
-HBe
为酶标记物，以四甲基联苯氨（
TMB
）和过氧
化物为底物。加入待测的标本，同时加入基因工程
HBeAg
和多抗
-HBe- HRP,
当标本中抗
-HBe
含量高时，
则抗
-HBe-HRP与
HBeAg
结合后
形成游离物被洗涤掉，加入
TMB
底物时显 色淡，反之则显色深。在试
验结束时，无颜色或颜色变化微弱的，提示有抗
-HBe
存 在，显色深
时，则提示不存在抗
-HBe
。

5
、


乙型肝炎病毒核心抗体检测：


采用
ELISA
“竞争抑制法”检测抗
-HBc
，用基因工程重组
H BcAg
包被板条，
用
HRP
标记的抗
-HBc
为酶标记物 ，
以四甲基联苯氨
（
TMB
）
和过氧化物为底物。加入待测标本，同 时加入抗
-HBc-HRP,
与抗原形
成竞争结合，当标本中抗
-HBc含量高时，则抗
-HBc-HRP
与
HBcAg
结
合少，加入< br>TMB
底物时显色淡，反之显色深。在试验结束时，无颜色
或颜色变化微弱的，提示有抗
-HBc
存在，显色深时，则提示不存在
抗
-HBc
。

二、样本要求

1
、无需空腹，可血清或血浆标本；新鲜标本无菌冷藏 １周可用；
可冷冻保存，但避免反复冻融。样品中含叠氮钠会影响结果；高
度溶血或没完全收缩 的血清样品或有微生物污染的样品可能会
引起错误的结果。

2
、试剂：我室“乙肝两对半”检测试剂盒由上海荣盛生物药业有
限公司提供

3
、设备：洗板机
1
台、酶标仪
1
台、微量振荡器< br>1
台、打印机
1
台、加样器
1
把、吸嘴（
50-25 0ul
）

三、操作步骤

1
、试剂盒准备


试剂贮存在
2-8
℃冰箱，实验前应提前
30min
取出，使其恢复至
室温，待用。

2
、加样


（
1
）准备实验所需反应孔

在以上实验原理中可以看出“ 乙
肝五项”中每个项目必须对应各自反应孔，不可错位摆放，否
则直接导致错误报告发出。

（
2
）乙肝表面抗原：第一步，先加样本
100ul< br>，温育
30-40min
；
第二步，加酶结合物
50ul
（< br>1
滴）
，温育
30min
，洗板
10
次，加
显色剂
A/B
各
1
滴显色看结果。


具 体步骤：
采用
“两步法”
，
结果需用酶标仪比色，
读取
OD
值。
每次试验，每块表面抗原测试板均需要设空白孔
1
孔、阴性对