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病理科免疫组织化学技术员培训及技术操作规范
一、病理科免疫组织化学技术员培训规范:
凡新入我科的病理技术员均需进行免疫组 化理论知识的学习、
培训,
经考核合格、
具备病理
技术员技士资质后方能从事 免疫组织化学染色。
二、病理科免疫组织化学染色操作规范
1.
免疫组织化学染色前的准备事项
(
一
)
组织切片的制备
常规切片脱蜡至水(组织固定需用
10%
中性甲醛)
(
二
)
抗体的选择、稀释和保存
(
1
) 选择抗体应先了解其反应谱和适用条件〔包括适用切片
(
石蜡切片抑或冷冻切片
)、稀
释度和温育时间等〕。
(
2
)对于未曾使用过的新抗体, 应按照有关说明书的提示,以几个不同的稀释度对适宜检
材
(
已知阳性切片
/
涂片
)
进行预试验
;
根据染色阳性表达的程度和检材背景着色程度,
确定用
于染色的最适稀释度
(
3
)抗体的原液应于分装后 置于一
20℃冷室中保存,切勿反复冻存
(
以免效价
降低
)
。
(
4
)抗体的工作液可置于
4℃冰箱中保存。
(
5
)抗体的稀释。
(1)
一般用
0.01M PBS(
生理盐水磷酸盐缓冲液
)
,pH
值
7.2
。
(2)
或用
0.05M TBS(
生理盐水三经基氨基甲烷缓冲液
)
,
pH
值
7.6
。
(3)
必要时可按需要加适量小牛血清清蛋白。
(
三
)
被检测组织内抗原的修复
(
1
) 经
4%
中性甲醛之类含醛基固定剂固定的组织,其切片中的抗原决定簇因醛的交联作用
而被封闭,
从而影响抗原一抗体反应。
进行免疫组织化学染色前,
对于组织切片进行抗 原修
复处理,
会使组织中的固有抗原尽量多地暴露出来,
提升了大部分检测抗体的阳性 率和反应
强度。
有的抗体不需要进行抗原修复。
应按抗体试剂说明书的提示决定是否进 行被检测组织
内的抗原修复。
(
2
)抗原修复缓冲液。
(l)
一般为
0.01M
柠檬酸缓冲液
(2.1g
柠檬酸溶 于
100ml
蒸馏水中,用
2M
NaOH
调节
pH
值至
6.0)
。
(2 )
有些抗体需要特殊修复缓冲液,如高
PH
值的
EDTA(50mM Tris.
,
10mM EDTA
,
pH9.0)
,
或商品化的该高,
10mM EDTA
,
pH9.0)
,或商品化的该高
pH
修复液等。
(
3
)抗原修复的常用方法。
(l)
胰蛋白酶消化法
:
①组织切片脱蜡、水化。
②滴加一滴
0.1%
胰蛋白酶液于组织切片上。
③37℃下温育
20-40min(
温育时间取决于组织经
4%
中性甲醛固定 时间的长短和被检测
抗原
)
。
④蒸馏水冲洗,终止反应。
⑤阻断内源性过氧化物酶。
⑥进行免疫组织化学染色。(配制
0.1%
胰蛋白酶液时,应将0.1g
胰蛋白酶溶于
0.1%
无水氯化钙水溶液
(pH
值7.8)
中。)
(
2)
胃蛋白酶消化法
:
①组织切片脱蜡、水化
.
②滴加胃蛋白酶工作液于组织切片上。
③37℃下温育
1 0-30min(
一般为
10min
,可延至
30min
,取决于组 织经
4%
中性甲醛固定
时间的长短
).
④浸人蒸馏水,终止反应。
⑤进行免疫组织化学染色。用
1%
胰蛋白酶液
37℃下处理
20min
。
(
应以
0.1M HCI
配制
胃蛋白酶工作液。过度的胃蛋白酶消化会使组织结构破坏、切片
脱落。
)
(
3)
微波修复抗原法
:
①组织切片脱蜡、水化
(
硅化玻片或经防脱片胶处理的玻片
)
。
②将组织切片置于容器
(
塑料盒或玻璃缸< br>)
中,
并向其中加人抗原修复液
200ml
,
盖上具
有小孔的盖子。
③将该容器 置于微波炉
(705-800W)
中央加热
(95
℃
)5min,
2
次
(
于两次之间,应向容器
中添加蒸馏水
50ml
,严防组织切片干燥
)
。
④将该容器移出微波炉,置于室温下冷却
15-20min
。
⑤蒸馏水冲洗。
⑥阻断内源性过氧化物酶,而后将切片置于蒸馏水中。
⑦用
TBS
或
PBS
液冲洗。
⑧进行免疫组织化学染色。
(4)
热水浴法
:
①组织切片脱蜡、水化
(
硅化玻片或经防脱片胶处理的玻片
)
。
②向装组织切片的容器加人足量
(
例如
200ml)
抗原缓冲液,置于水浴锅中,加热至
95
-
99℃(不沸腾
)
预热。
③将组织切片插人已预热的容器内,温育
20-40min
。
④将该容器由微波炉移出,置于室温下冷却
20min
。
⑤室温下,用
TBS
、
PBS
或水洗。
⑥蒸馏水冲洗。
⑦阻断内源性过氧化物酶,而后将切片置于蒸馏水中。
⑧用
TBS
或
PBS
液冲洗。
⑨进行免疫组织化学染色。
(
5)
压力锅法
:
①组织切片脱蜡、水化
(
硅化玻片或经防脱片胶处理的玻片
)
。
②向
4-5.5L
的不锈钢压力锅中加人抗原修复缓冲液
(
约为锅容积的
2/3)
,
不加阀情况
下加热至沸腾。
③将组织切片插放于金属切片架上,并置于压力锅内沸腾的缓冲液中。
④加阀情况下,将组织切片加压
2min
。
⑤压力锅自行冷却或以流水冷却减压后,持续
20min
。
⑥将冷却后的切片取出,蒸馏水冲洗后,置于
TBS
或
PBS
液中< br>(
以免组织切片干燥
)
。
⑦蒸馏水冲洗。
⑧阻断内源性过氧化物酶,而后将切片置于蒸馏水中。
⑨用
TBS
或
PBS
液冲洗。
⑩进行免疫组织化学染色。
(四)组织切片中内源性酶的阻断
1.
内源性过氧化物酶
主要存在于红细胞、
嗜中性粒细胞、
单核 细胞了嗜酸性粒细胞和
组织内。阻断方法
:
最常用
0.3%-0.5%H2O 2-
甲醇液,作用
15-30min
,
阻断液必须使用时新
鲜配制。
由于阻断内源性过氧化物酶常同时导致被测抗原变性
(
使特异性着色减弱< br>)
,
而大部
分组织不含有内源性过氧化物酶,
所以阻断内源性过氧化物 酶一般不必作为常规步骤。
必须
阻断内源性过氧化物酶时,可安排在第一抗体反应后进行,以减 少抗原的破坏。
2.
内源性碱性磷酸酶
主要存在于嗜中性粒 细胞和内皮细胞。
阻断方法
:
应用
1M
左旋咪唑,
作用15-30min
。
3.
内源性生物素
肝、
胰、
肾等的细胞内含有多量生物素或类生物素物质。
阻断方法
:
先将切片浸于卵白素
(0.5
μ
g/ml)
中
1 5min
,以缓冲液洗净后,移浸于生物素饱和溶液中
15min
,再用缓冲液洗去多 余的生物素饱和液
;
也可应用商供的阻断试剂盒
(
按说明书操作
)< br>。
(
五
)
正常血清保护
作为检测试剂的抗体蛋白带有一定的负电荷,
免疫组织化学染色时,
易与带有正电荷的
组织〔特别是纤维组织、
变性和
(
或
)
坏死的细胞、
嗜酸性粒细胞等〕发生静电吸引而导致非
特异性染色。
去除这种非特异性染色最有效的方法是 ,
在滴加第一抗体前,
先滴加用于制备
第二抗体动物的非免疫血清或是滴加除制备第一 抗体动物以外的其他动物非免疫血清,
浓度
为
1
:
5-1
:
20;
必要时可滴加
2%-5%
牛
血清清蛋白。正常血清 保护作用时间
10-20min
。用
于阻断非特异性结合的血清不能有明显的溶血。< br>
(
六
)
缓冲液
用于稀释抗体,洗涤切片的缓冲液主要有两种。
(0.05M
,
pH7.6)
,
Tris
一
HCl
缓冲液
(0 .SM
,
pH 7.6) 100ml
8 .5%NaCl 100ml
蒸馏水加至
1000ml
Tris
一
HCI
缓冲液
(0 .5M
,
pH7.6)
三经甲基氨基甲烷
(Tris) 61g
HCl 37ml
蒸馏水加至
1000ml
2
.
PBS(0 .IM
,
pH 7.6)
Na2 HPO4
·
12H2O2 29g
NaH2PO4
·
2H2O 3g
NaCl 85g
蒸馏水加至
1000ml
使用时用蒸馏水稀释
10
倍即成
0.0lM
。
二、免疫组织化学染色常用方法
(
一
)
直接法
1.
脱蜡和水化。
2.3%
过氧化氢或
0.5%
过氧化氢甲醇液,
5min
。
或
PBS
缓冲液洗涤。
4.
抗原修复。
5.
无关动物正常血清
(
适当稀释
)20-30min
。
6.
甩去正常动物血清,滴加适当稀释的辣根过氧化物酶标记抗体,或增强的酶标多 聚
物一步法
(Enhanced Polymer One-step Staining
,
EPOS)
抗体于切片上,
20-60min
。
或
PBS
缓冲液洗涤。
8.0.04%-0.05%D AB(
二氨基联苯胺四盐酸
)H2O2
液显色
5-10min
,镜下 观察控制显色时
间。底物配法
:DAB 40-50mg
;
0.05M TBS(pH 7.6) l00ml
;
3% H2O2 100-200ml
。
9.
缓冲液洗,流水洗涤。
10.
苏木精淡染细胞核。
11.
脱水,透明,封片。
(
二
)
间接法
l-5
步同“直接法”。
6.
滴加第一抗体于切片上,湿盒内温育
30-60min
。
或
PBS
缓冲液洗涤。
标记抗体或用增强的酶标记多聚物
(Enhanced
Labeled
一
Polymer
Sys-
tem
,
ELPS)
抗体滴加切片上,湿盒内温育
30min
。
9-14
步同“直接法”的
7-11
步。
(
三
)
过氧化物酶一抗过氧化物酶
(PAP)
法
1-5
步同直接法。
6.
适当稀释的第一抗体,湿盒内温育
30-60min
。
7.
缓冲液洗涤。
8.
第二抗体,湿盒内温育
30min
。
9.
缓冲液洗涤。
10.
滴加
PAP
,湿盒内温育
30min
。
11-15
步同“直接法”的
7-11
步。
双< br>PAP
法
:
上述操作进行到第
10
步后,再重复
7- 10
步
1
次,然后继续
11-15
步。
(
四
)
葡萄球菌
A
蛋白
(SPA)
免疫酶法
1-5
步同“直接法”。
6.
第一抗体,湿盒温育
30-60min
。
7.
缓冲液洗涤。
8.
酶联
SPA
,湿盒温育
30min
。
9.
缓冲液洗涤。
10-13
步同“直接法”的
8-11
步。
(
五
)ABC
法和
SABC
法
ABC
法是卵白素
-
生物素
-
酶复合物
(Avidin-- Biotin--Peroxidase Complex)
法的简称。
SABC
法是 链霉卵白素
-
生物素
-
酶复合物
(Streptavidin
一
Biotin
一
peroxidase Complex)
法的简称。
l-5
步同“直接法”。
6.
第一抗体,湿盒温育
30-60min.
7.
缓冲液洗涤。
8.
生物素化的第二抗体,
30min
。
9.
缓冲液洗涤。
复合物或
SABC
复合物(
皆于使用前新鲜配制
)
,
30-60min
。
11-15
步同“直接法”7
-11
步。
(
六
)LSAB(SP)
法
LSAB(SP)
法 ,
是标记的链酶卵白素
-
生物素
(Labeled
Streptavidin--Biotin)
法的简称,
操作步骤同“ABC
法”,只是以
LSAB
复合物替代
ABC
复合物。
(
七
)CSA
法
CSA
法是催化信号放大
(Catalyzed Signal Amplifieation)
法的简称。
1-5
步同“直接法”。
6.
第一抗体,
15-30min
。
7.
缓冲液洗涤。
8.
生物素标记的第二抗体,
15-30min
。
9.
缓冲液洗涤。
10.
链霉卵白素
-
生物素< br>-HRP
复合物
(
用前新鲜配制
)
,
15min。
11.
缓冲液洗涤。
12.
放大液,
15min
。
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