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食品专业毕业论文

作者:陕西保健网
来源:http://www.xapfxb.com/yuer
更新日期:2021-01-21 14:40

越南hkt洗剪吹组合-

2021年1月21日发(作者:周海媚)














Coca-cola standardization office

ZZ5AB- ZZSYT-ZZ2C-ZZ682T-ZZT18







:

重组乙醛脱氢酶的分离纯化及其酶学性质研究




:




:










:




:




:

指导教

:






























职称
:























重组乙醛脱氢酶的分离纯化及其酶学性质研究



摘要:【目的】研究工程菌
BL21(DE3)/pET32a-istALDH
产 乙醛脱氢酶的纯化和酶学性
质。【方法】工程菌经过
IPTG
诱导后产生乙醛脱氢酶,通过
Ni-NTA
亲和层析纯化,
得到纯度较高的 酶蛋白,并对纯酶进行了酶学性质及动力学研究。【结果】酶最终被
纯化了
9
倍,并达 到电泳纯。经过
SDS-PAGE
测得该酶的分子量约为
57 kDa
。以 乙醛
为底物,酶促反应的最适温度为
40℃,最适
pH
值为,热稳定性和酸碱 稳定性相对较
差;金属离子
K
+

Li
+

AL
3+
对酶均具有激活作用,而
Ag
+

Zn
2+

Gu
2+
对酶促反应具有强
烈的抑制作用,酶活性基本丧失, 在化合物
EDTA

DTT
中活性明显提高,
SDS
使酶完 全
丧失活性;反应的最适底物是乙醛和
NAD
+
,
乙醛和
N AD
+
动力学常数
Km
值分别为
L

L

最大反应速度
Vmax
分别为
mg

mg
。【结论 】研究为重组乙醛脱氢酶纯酶的纯化、得
到稳定性好、活性高的酶反应体系及利用该酶进行催化反应和工 业化应用提供了重要
参数。


关键词:乙醛脱氢酶;纯化;酶学性质


Study on Purification and Characterization of
Recombinant ALDH


Student majoring in National Life Science and Technique Talent Training
Base? Jie Xu

Tutor Zhaoxin Lu

Abstract

[Objective]
To purify and characterize recombinant aldehyde
dehydrogenase expressed in engineered strain
E. Coli
BL21(DE3)/pET32a-
istALDH.
[Methods]
The aldehyde dehydrogenase gene was expressed in
engineered strain after IPTG induction and the crude enzyme was obtained by
sonication. We purified the recombinant aldehyde dehydrogenase by using
metal chelate affinity chromatography on a Ni-NTA column. Then we
characterized catalytic kinetic parameter of purified enzyme.
[Results]
The
molecular weight of aldehyde dehydrogenase measured by SDS-PAGE was kDa.
The enzyme had an optimum temperature at 40℃, and an optimum pH of . It
was unstable with thermostability and pH stability. Metal ions K
+

Li
+
and
AL
3+
could active the enzyme activity, while Ag
+

Zn
2+
and Gu
2+
could strongly
inhibit the enzyme activity. The compounds EDTA and DTT could active the
enzyme apparently while SDS could greatly inhibit the enzyme. The optimal
substrates were acetaldehyde and NAD
+
with the kinetic constant Km of
mmol/L and mmol/L, respectively and Vm of mg and mg,
respectively.
[Conclusion]
These results may provide an important basis for
industrial applications of the recombinant aldehyde dehydrogenase.




Key words:
aldehyde dehydrogenase; purification; characterization


引言

目前与酒精中毒关 系密切的许多候选基因中研究最多的就是参与乙醇代谢的乙醇
脱氢酶
(alcohol dehydrogenase

ADH)
和乙醛脱氢酶
(aldehyde dehydrogenase

ALDH)
[1-2]
。前者使乙醇转化为乙 醛,后者使乙醛进一步转化为乙酸,最终分解为二氧化
碳和水

3

。乙醛脱氢酶属于氧化还原酶类,广泛存在于微生物、植物和动物体中

4


在人体中,一般都存在前一种酶,而且数量基本相等,但缺少后一种酶的人就比较
少,此酶突 变后活性缺失,导致乙醛在肝脏内大量累积,导致肝脏损伤及某些癌症疾


5-6< br>】
,因此在细胞解毒研究中乙醛脱氢酶受到高度关注。

国内外对于乙醇脱氢酶 的酶学性质、分离纯化等研究比较成熟,而对于
ALDH
的研
究较少

7

,国内已有相关研究如乙醛脱氢酶基因在甜菜、菠菜和水稻中

8-1 0

的表达等
等,目前,
ALDH
的提取一般是以动物为原料,主要 是从动物的肝脏中提取,这制约了
该酶的产量
[11-12]
,通过微生物发酵、分离 纯化
ALDH
具有很大的市场前景,

本课题通过从重组大肠杆菌中分离纯化 得到
ALDH
,并对其进行酶学性质的测定
,

乙醛脱氢酶的工业化 应用奠定基础。乙醛脱氢酶分离纯化及其性质的研究对将来控制
和减少酒精性肝病的预防和健康教育工作 有重要意义

1
材料与方法



材料

菌株

基因工程菌
E. Coli
BL21(DE3)/pET3 2a-istALDH
由食品院酶工程实验室构建、保
藏。

培养基

LB
培养基(
w/v
):胰蛋白胨
10
,酵母粉
5

NaCl 10

pH
。121℃高压灭菌
20min


主要试剂

I PTG(
上海生工生物有限公司
)
;牛血清白蛋白(国药集团化学试剂有限公司);< br>凝血酶为标准品(中国药品生物制品检定所);琼脂糖(电泳级)(中国医药(集
团)上海化学试 剂公司);考马斯亮蓝
G-250
(美国
Sigma
公司);酵母提取物、胰 蛋
白胨等(英国
Oxoide
公司);乙醛、甲醛、丁醛、戊醛等醛类物质;
EDTA

DTT

2-
ME

SDS

PMSF
等化合物;其它试剂均为市售分析纯。


主要仪器

手体式压力蒸汽灭菌锅(上海医用核子仪器厂)

BC/BP-225SB
海尔冰柜(海尔集团)

OPIONpH

MODEL818

PYX-DHS-50X65
隔水式电热恒温培养箱(上海跃进医疗器械厂)

UV-1601
紫外分光光 度计
(
日本
SHIMADZU
公司
)

HYG-A
全温摇瓶柜
(
太仓实验设备厂
)

Sa rtorious
电子精密天平
(
北京赛多利斯天平有限公司
)

SW-CJ- IBU
洁净工作台
(
苏州安泰空气技术有限公司
)

Centrifuge 5804R
冷冻离心机
(
德国
eppend orf
公司
)

BS-100A
自动部分收集器
(
上海沪西分析仪器厂
)

BIO-RAD PAC1000
微型电泳仪
(BIO-RAD
生命医学产品有限公司
)



凝胶成像系统
Gel Doc2000

BIO- RAD
公司)

1

2
方法


乙醛脱氢酶的表达和制备

从保存于
-
70℃超低温冰箱的基因工程 菌甘油菌中挑取少许菌液划线于
LB
平板
(含氨苄青霉素
100
μ< br>g/mL

%
葡萄糖),37℃培养
12-14h
,挑单菌落 接入
LB
培养基
(含氨苄青霉素
100
μ
g/mL

%
葡萄糖)于
30℃、
100rpm
培养过夜(
11h< br>),然后以
4%
的接种量转接到
100mL

LB
培 养基(含氨苄青霉素
100
μ
g/mL

%
葡萄糖),37 ℃、
180rpm
培养约至
OD600
为时,加入
IPTG
至终浓度为
ml
,15℃、
180rpm
培养
15h
诱导< br>乙醛脱氢酶的表达。将
100mL
发酵液于
4℃、
9000rpm离心
10
分钟收集菌体,重悬于
50mmol/L K
2
HPO4-KH
2
PO4
缓冲液(
pH
)中,冰水浴中超声
5s
,间歇
10s

400W
破碎
15min
后,
10,000rpm
离心
15min
收集上清即得粗酶液。


乙醛脱氢酶的纯化

用缓冲液
(

50mmol/L PBS

L NaCl, pH
平衡床体积为
2mL

Ni-NTA
小柱,在粗
酶液 加入
5mmol/L
咪唑后上样,样品过三次,然后分别用
10
倍介质体积的 浓度为
50

100

150

200

500mmol/L
咪唑洗脱,每
2ml
收集一管,测定酶活,收集洗脱
液后经
SDS- PAGE
电泳和考马斯亮蓝染色鉴定纯化蛋白。



乙醛脱氢酶活力测定

酶活测定体系(
3mL
):
mol/L Tris-HCl

2mmol/L
乙醛,
mmol/L NAD
+

10
mmol/L 2-
巯基乙醇,
mol/L KCl
,待测酶液。用分光光度法,在
25℃、
340nm
下测 定
NADH
吸光度的变化。定义每分钟催化还原
1
μ
mol NAD
+
所需要的酶量为一个酶活单位。


蛋白含量测定

采用
Bradford


13

,以牛血清白蛋 白为标准蛋白,测
595nm
处吸光值,计算蛋
白质含量。


纯度鉴定和分子量测定

采用垂直板
SDS-PAGE
电泳测定乙醛 脱氢酶的纯度和分子量,分离胶浓度为
12%

浓缩胶浓度为
5%



乙醛脱氢酶酶学性质


酶的最适反应
pH

pH
稳定性

在不同
pH
的缓冲液(
L Tris- HCL
缓冲液
,

L
磷酸钾缓冲液
,pH
–;
L
甘氨酸
-

氧化钠缓冲液,
pH
–)中测定酶活力,研究酶促反应的最适反应
pH
。将酶液分别置于
不同
pH
的缓冲液中,30℃保温
1 h
,按常规酶活测定方法测定剩余酶活力,以未处理的酶活为
100%
,研究酶的酸碱稳定性。

酶的最适反应温度及热稳定性

在不同温度下测定酶活力,考察酶的最适反应温度。将酶液在不同温度水浴锅中
保温
2 h
,每
15min
取样测量其对应的剩余酶活力,以未处理的酶活为
100%
,考察酶
的热稳定性。


金属离子和其他化合物对酶活力的影响

在不同反应体系中分别加入
mmol/L

mmol/L
的各种金属离子和化合物,测定酶
活力,以未 加入的酶液做对照,观察金属离子和化合物对酶活力的影响。

不同底物对酶活性的影响

用不同底物取代原测定方法中的底物,测定酶的活力,考察 酶的最适作用底物。
以原测定方法中的底物测得的酶活力作为对照。

动力学常数
Km
和最大反应速度
Vmax
的测定

将酶液分别与不同浓度的乙醛和
NAD
+
底物作用,测定酶反应的初速度,用
Lineweaver-Burk
双倒数作图法求出以乙醛和
NAD
+
为底 物的
Km
值和
Vmax



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