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凋亡蛋白质的原核表达与纯化-最新文档

作者:陕西保健网
来源:http://www.xapfxb.com/yuer
更新日期:2021-01-21 14:28

新挑战驱魔师加点-

2021年1月21日发(作者:康殷)
凋亡蛋白质的原核表达与纯化



Expression, Purification and Activity Detection in
vitro of Apoptin


FU Wen-bing1, SHI Xuan1, ZHAO Jian1*, FAN Li-qiang1,
LI Su-xia, WANG Fu-jun2, SONG Yu-wen1, YUAN Qing-sheng1


(1. State Key Laboratory of Bioreactor Engineering,
East China
University
of Science
and Technology,
Shanghai
200237,
China;
2.
Zhejiang
Rishengchang
Pharmaceutical
Co.,
Ltd, Zhejiang 322100, China)




Objective
To
construct
an
soluble
expression
system
in E. coli for apoptin which was encoded by VP3 gene of
chicken
anemia
virus
(CAV),
and
study
the
purification
and
stabilization of apoptin. Methods The VP3 gene was
amplified by PCR , then the segment was inserted into
pET-28a (+) and the expression vector pET-28a-VP3 was
constructed
in
E. coli BL21(DE3). The
recombinant soluble
protein was expressed in E. coli BL21(DE3)and purified by
Ni-NTA
column
chromatography.
The
stability
of
apoptin
was
analyzed under different conditions. Results The target
protein was expressed in E. coli BL21(DE3). The purity of
apoptin was beyond 90 %after purification. The target
protein was better stabilized by carrageenan in
BL21(DE3). Conclusion Apoptin with high purity and
stability
can
be
successfully
obtained,
which
do
a
base
of
the further study on clinic application of apoptin.


凋亡蛋白 质是鸡贫血病毒(
CAV
)的
VP3
基因编码的小分子
蛋白质,
121
个氨基酸组成,
含有
2
个脯氨酸富含区和
2< br>个碱
性区,近
N
端(
33

44a
)含有一 个
11
个氨基酸组成的核运输序
列(
NES
),靠近
C端(
84

90

112

118
) 含有
2
个核定位序
列(
NLS
)。



Noteborn

[1]
研究揭示,凋亡蛋白质能够诱导人的肝癌、
淋巴瘤、白血病、乳腺癌、肺癌等多种癌细胞的凋亡,以及转化
细胞的凋亡,但对未转化的人双倍体细 胞无损伤
[2]
。凋亡蛋白
质的核定位可能是其诱发细胞凋亡的前提之一
[3 ]
。凋亡蛋白质
选择性诱导肿瘤细胞的凋亡不同于通常的凋亡机制,
它不是通过
半胱天冬酶级联反应进行的,
不需要
p53
参与,
也不被
bcl- 2

过表达抑制,反而能被
bcl-2
所促进
[4]
。由于 大部分肿瘤细胞
具有
p53
突变或缺失,
这种非
p53
依赖 性使凋亡蛋白质作为抗肿
瘤药物有很好的前景。



在许多关于 凋亡蛋白质表达和纯化的研究中,
凋亡蛋白质多
以包涵体形式表达。
本实验以
pET-28a
为载体进行凋亡蛋白质的
原核表达,
尝试不同的诱导条件及纯化方法,
找到了可溶性目的
蛋白质表达的条件,
用金属螯合层析法直接纯化得到较高得率的活性目的蛋白质,
并研究其稳定性。
本研究对凋亡蛋白质作为肿
瘤治疗药物应用于 临床具有积极意义。



1
材料和方法



1.1
质粒、菌株和试剂



含有凋亡蛋白 质全长基因的质粒
pET-11a-VP3
(浙江日升昌
药业
XX
公 司提供);质粒
pET-28a
和菌株
BL21(DE3)
等(本实
验室保存)

低相对分子质量蛋白质和
DNA
Mark

Sigma
公司)

IPTG
(异丙基
-
β
-D-
硫代半乳糖苷)(
BBI
分装);
SDS
(十二
烷基磺酸钠 )(
Amresco
分装);限制性内切酶、
T4-
连接酶、
Taq
酶(
MBI
公司);其它化学试剂均为国产分析纯。



1.2
原核表达重组质粒的构建



VP3
基 因来源于
pET-11a-VP3
质粒。
PCR
引物分别为
P1
5’
-AATTTCAAC ATATGAACG CTCTCCAAG-
3’;
P2
:5’
-
CGTCGGATCCTATT ACAGTCTTATACGC-
3’。分别引入
N deI

BamHI
位点。
PCR
产物经
NdeI

BamHI
双酶切后,回收的
VP3
基因片
段与经同样双酶切的质 粒
pET-28a
连接和转化。抽提质粒,用
BamHI

NdeI
对重组质粒进行双酶切鉴定得到阳性重组质粒。



1.3
凋亡蛋白质的原核表达及纯化



1.3.1< br>凋亡蛋白质的表达与鉴定将含有重组质粒
pET-28a-VP3

BL21( DE3)
菌株接种于
LB
培养基中,37 ℃培养
过夜,次日按
1∶ 100
的比例稀释后放大培养,至一定菌体浓度
时,加入适量
IPTG
诱导培 养,离心收集菌体。



SDS-PAGE
分析
12 % SDS-PAGE
电泳,电压
100 V
,待样品
即将进入分离胶时,调节至
120 V
。电泳后凝胶用考马斯亮蓝溶
液(
45 %
甲醇,
10 %
乙酸,
0.25 %
考马斯亮蓝
R 250
)染色。



1.3.2
可溶性目的蛋白质的纯化将 新鲜菌
体按
1∶5(W∶V)的比例用
Tris- HCl
缓冲液(
10 mmol/L
Tris-HCl

10
%
甘油,
pH
8.5
)重悬,保持在冰浴中,超声破碎
至菌液澄清。4 ℃,10 000×g
离心
20 min
,取上清,
Ni-NTA
Agarose
金属亲和树脂(
Qiagen
公司)分离纯化。将上清液加
入经
Tris-HCl
缓冲液平衡的
Ni-NTA
介质中,4
℃结合
60
min

将混合物小心加入下端封闭的层析柱后,除去下端封盖,
收集流
出液(穿出峰)。以
15
mL

20
mmol/L
咪唑的磷酸缓冲液漂洗
后,再分别以
15
mL

40

60

100

200
mm ol/L
咪唑的磷酸缓
冲液洗脱目的蛋白质。
分别收集洗脱组分,
进行
SDS-PAGE
鉴定,
Bradford
法测定蛋白质浓度,凝胶扫描软件分析纯 度。



1.4
凋亡蛋白质溶液稳定性研究



将重组表达的凋亡蛋白质于
4 ℃放置
3 d
后,取样进行
SDS-PAGE
电泳鉴定,对照
3 d
前样品观察 凋亡蛋白质在溶液状
态中的稳定性。通过改变离子强度(增加
NaCl
浓度)和添加不
同稳定剂来增加凋亡蛋白质的稳定性。



2
结果



2.1
重组表达质粒的构建




pET-1 1a-VP3
为模板扩增
PCR

得到预期大小的目的片断。

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